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CFDA SE 的關(guān)鍵特性與作用機(jī)制

CFDA SE 是一種功能強(qiáng)大的細(xì)胞示蹤染料，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖研究。它通過(guò)被動(dòng)運(yùn)輸進(jìn)入活細(xì)胞，被胞內(nèi)酯酶轉(zhuǎn)化為熒光 CFSE，發(fā)出明亮綠光。CFSE 與細(xì)胞蛋白結(jié)合后穩(wěn)定保留，隨細(xì)胞分裂熒光均分，熒光強(qiáng)度減半，可用于識(shí)別不同分裂代次細(xì)胞。CFDA SE 標(biāo)記非分裂細(xì)胞熒光穩(wěn)定，可持續(xù)數(shù)月，非常適合細(xì)胞群落分析。其熒光均一性?xún)?yōu)于 PKH26，分裂后子代細(xì)胞熒光分配均衡，且能檢測(cè)多達(dá)八次甚至更多細(xì)胞分裂。

操作步驟詳解

細(xì)胞準(zhǔn)備與處理

• 細(xì)胞選擇與培養(yǎng) ：依據(jù)研究目的挑選合適的細(xì)胞系，確保細(xì)胞狀態(tài)良好，生長(zhǎng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在相應(yīng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)并定期換液。

• 細(xì)胞計(jì)數(shù)與濃度調(diào)整 ：準(zhǔn)確計(jì)數(shù)細(xì)胞后，調(diào)整濃度至實(shí)驗(yàn)所需范圍，如

  $1 \times 10^5$

  -

  $5 \times 10^6$

  個(gè) / mL，以保證標(biāo)記效果和后續(xù)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性。

CFDA SE 染料準(zhǔn)備

• 染料配制 ：按試劑盒說(shuō)明，將 CFDA SE 溶于無(wú)血清培養(yǎng)基或適當(dāng)緩沖液，配制成工作液，濃度一般為 1 - 10 μM。根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型和實(shí)驗(yàn)需求優(yōu)化濃度，避免濃度過(guò)高或過(guò)低影響標(biāo)記效果。

• 染料預(yù)熱 ：將配制好的染料工作液置于 37℃水浴中預(yù)熱 5 - 10 分鐘，以促進(jìn)染料更好地穿透細(xì)胞膜，提高標(biāo)記效率。

細(xì)胞標(biāo)記過(guò)程

• 細(xì)胞與染料混合 ：將預(yù)熱后的 CFDA SE 工作液與細(xì)胞懸液按一定比例混合，輕輕吹打混勻，使細(xì)胞與染料充分接觸。通常 CFDA SE 與細(xì)胞的混合比例為 1:1 或根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求調(diào)整。

• 標(biāo)記孵育 ：將混合好的細(xì)胞與染料置于 37℃、5% CO? 的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育 10 - 20 分鐘，使 CFDA SE 充分進(jìn)入細(xì)胞并被酯酶轉(zhuǎn)化為 CFSE。孵育時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，以免細(xì)胞因缺氧等原因提前凋亡或影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

細(xì)胞洗滌與后續(xù)培養(yǎng)

• 洗滌去除未結(jié)合染料 ：孵育結(jié)束后，用預(yù)冷的含有血清的培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞 2 - 3 次，以去除未結(jié)合的 CFDA SE 染料。洗滌過(guò)程中動(dòng)作要輕柔，避免細(xì)胞聚集或損傷。

• 細(xì)胞重懸與培養(yǎng) ：將洗滌后的細(xì)胞重懸于適量的培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞濃度至合適范圍，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，如細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)或細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)等。

結(jié)果檢測(cè)與分析

流式細(xì)胞儀檢測(cè)

• 儀器設(shè)置與參數(shù)調(diào)整 ：使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞熒光強(qiáng)度，設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為 488 nm，檢測(cè)綠色熒光（FL1 通道）。根據(jù)細(xì)胞熒光強(qiáng)度的不同，區(qū)分未分裂細(xì)胞和不同分裂代次的細(xì)胞。

• 數(shù)據(jù)采集與分析 ：采集熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，通過(guò)流式細(xì)胞儀軟件進(jìn)行分析。根據(jù)熒光強(qiáng)度的分布，計(jì)算不同分裂代次細(xì)胞的比例，從而評(píng)估細(xì)胞的增殖情況。通常，未分裂細(xì)胞具有最高的熒光強(qiáng)度，每分裂一次熒光強(qiáng)度減半。

熒光顯微鏡觀察

• 顯微鏡設(shè)置與觀察 ：在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的熒光標(biāo)記情況，使用激發(fā)波長(zhǎng)為 488 - 500 nm 的藍(lán)光激發(fā)細(xì)胞，觀察細(xì)胞內(nèi)綠色熒光的分布和強(qiáng)度。

• 圖像拍攝與記錄 ：拍攝細(xì)胞熒光圖像，記錄細(xì)胞的標(biāo)記效果和增殖情況。通過(guò)圖像分析軟件對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析，進(jìn)一步評(píng)估細(xì)胞增殖程度。