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Fluo-4 鈣離子檢測試劑盒的關(guān)鍵特性與優(yōu)勢

Fluo-4 鈣離子檢測試劑盒是一種基于 Fluo-4 AM 鈣離子熒光探針的細胞內(nèi)鈣離子濃度檢測工具。該試劑盒適用于多種檢測方法，包括熒光顯微鏡成像、熒光酶標(biāo)儀和流式細胞儀定量檢測，還支持細胞內(nèi)鈣離子濃度的動態(tài)變化監(jiān)測。Fluo-4 是 Fluo-3 的衍生物，將 Cl 離子替換為電子吸引力更強的 F 離子后，其最大激發(fā)波長較 Fluo-3 短約 10 nm，更接近氬激光器波長，使得 Fluo-4 在氬激光器激發(fā)下熒光強度更高，檢測靈敏度也相應(yīng)提升。

操作步驟詳解

細胞準(zhǔn)備與處理

• 細胞培養(yǎng) ：選擇合適的細胞類型進行培養(yǎng)，確保細胞處于良好的生長狀態(tài)。將細胞培養(yǎng)在相應(yīng)的培養(yǎng)基中，定期更換培養(yǎng)液，保證細胞的活力和正常代謝。

• 細胞計數(shù)與濃度調(diào)整 ：使用細胞計數(shù)板或自動細胞計數(shù)儀精確計數(shù)細胞，調(diào)整細胞濃度至實驗所需范圍，一般為

  $1 \times 10^5$

  -

  $5 \times 10^6$

  個 / mL，以確保標(biāo)記效果和后續(xù)檢測的準(zhǔn)確性。

Fluo-4 AM 染料準(zhǔn)備

• 染料配制 ：根據(jù)試劑盒說明書，將 Fluo-4 AM 溶于適當(dāng)?shù)臒o血清培養(yǎng)基或緩沖液中，配制成工作液，濃度一般為 1 - 10 μM。根據(jù)細胞類型和實驗需求優(yōu)化濃度，以避免濃度過高或過低對細胞造成影響或影響標(biāo)記效果。

• 染料預(yù)熱 ：將配制好的 Fluo-4 AM 工作液置于 37℃水浴中預(yù)熱 5 - 10 分鐘，以促進染料更好地穿透細胞膜，提高標(biāo)記效率。

細胞標(biāo)記過程

• 細胞與染料混合 ：將預(yù)熱后的 Fluo-4 AM 工作液與細胞懸液按一定比例混合，輕輕吹打混勻，使細胞與染料充分接觸。通常 Fluo-4 AM 與細胞的混合比例為 1:1 或根據(jù)實驗需求調(diào)整。

• 標(biāo)記孵育 ：將混合好的細胞與染料置于 37℃、5% CO? 的細胞培養(yǎng)箱中孵育 30 分鐘至 1 小時，使 Fluo-4 AM 充分進入細胞并被細胞內(nèi)酯酶轉(zhuǎn)化為 Fluo-4。孵育時間不宜過長，以免細胞因缺氧等原因提前凋亡或影響后續(xù)實驗。

細胞洗滌與后續(xù)操作

• 洗滌去除未結(jié)合染料 ：孵育結(jié)束后，用預(yù)冷的含有血清的培養(yǎng)基洗滌細胞 2 - 3 次，以去除未結(jié)合的 Fluo-4 AM 染料。洗滌過程中動作要輕柔，避免細胞聚集或損傷。

• 細胞重懸與培養(yǎng) ：將洗滌后的細胞重懸于適量的培養(yǎng)基中，調(diào)整細胞濃度至合適范圍，進行后續(xù)實驗。

結(jié)果檢測與分析

熒光顯微鏡檢測

• 顯微鏡設(shè)置與觀察 ：在熒光顯微鏡下觀察細胞的熒光標(biāo)記情況，使用激發(fā)波長為 490 - 510 nm 的藍光激發(fā)細胞，觀察細胞內(nèi)綠色熒光的分布和強度。Fluo-4 標(biāo)記的細胞在受到刺激導(dǎo)致鈣離子濃度升高時，熒光強度會顯著增強。

• 動態(tài)變化監(jiān)測 ：通過熒光顯微鏡的時間序列成像功能，可以實時監(jiān)測細胞內(nèi)鈣離子濃度的動態(tài)變化。在細胞受到刺激后，觀察熒光強度的變化情況，記錄鈣離子濃度的瞬時變化，分析細胞的信號傳導(dǎo)過程。

熒光酶標(biāo)儀檢測

• 儀器設(shè)置與參數(shù)調(diào)整 ：使用熒光酶標(biāo)儀檢測細胞內(nèi)鈣離子濃度時，設(shè)置激發(fā)波長為 490 - 510 nm，發(fā)射波長為 520 - 540 nm。根據(jù)細胞熒光強度的不同，可以定量分析細胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。

• 數(shù)據(jù)采集與分析 ：將標(biāo)記好的細胞懸液加入到 96 孔板中，每個孔加入適量的細胞懸液。在熒光酶標(biāo)儀上進行檢測，采集熒光強度數(shù)據(jù)。通過分析熒光強度的變化，可以計算細胞內(nèi)鈣離子濃度的變化情況，評估細胞的活性和功能狀態(tài)。

流式細胞儀檢測

• 儀器設(shè)置與參數(shù)調(diào)整 ：使用流式細胞儀檢測細胞內(nèi)鈣離子濃度時，設(shè)置激發(fā)波長為 488 nm，檢測綠色熒光（FL1 通道）。根據(jù)細胞熒光強度的不同，可以區(qū)分不同鈣離子濃度的細胞群體。

• 數(shù)據(jù)采集與分析 ：將標(biāo)記好的細胞懸液調(diào)整至適當(dāng)濃度，一般為

  $1 \times 10^5$

  -

  $1 \times 10^6$

  個 / mL，通過流式細胞儀進行檢測。采集熒光強度數(shù)據(jù)，通過分析細胞群體的熒光強度分布，可以評估細胞內(nèi)鈣離子濃度的異質(zhì)性和動態(tài)變化。