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外周血單個核細(xì)胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC），是指外周血中具有單個核的細(xì)胞，包括淋巴細(xì)胞（Lymphocyte）、單核細(xì)胞（Monocyte）、樹突狀細(xì)胞（DC）和其他少量細(xì)胞。

1     原理

單個核細(xì)胞的體積、形態(tài)和比重與外周血其它細(xì)胞不同，紅細(xì)胞和多核白細(xì)胞的比重超過1.080，單個核細(xì)胞的比重為1.070左右，血小板為1.030左右。因此，可利用各種血細(xì)胞和單個核細(xì)胞比重之間的差異將各種血細(xì)胞與單個核細(xì)胞分離開來。

Ficoll密度梯度離心法是分離、純化PBMC的方法。Ficoll是蔗糖的多聚體，中性，平均分子量400000，當(dāng)密度為1.2g/mL，未超出正常生理性滲透壓，也不穿過生物膜，故常用作PBMC分離的分離液。紅細(xì)胞、粒細(xì)胞比重大，離心后沉于管底；淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的比重小于或等于分離液比重，離心后漂浮于分離液的液面上，也可有少部分細(xì)胞懸浮在分離液中。吸取分層液液面上的白膜層細(xì)胞，并進(jìn)行適當(dāng)?shù)那逑矗涂蓮耐庵苎蟹蛛x到較高純度的單個核細(xì)胞，即PBMC。

2     方法

1）取新鮮抗凝全血，按照1：1比例加入1×稀釋洗滌液，將血液進(jìn)行稀釋（以降低血液粘稠度），輕柔混勻，備用。

2）向無菌離心管內(nèi)加入適量的單個核細(xì)胞分離液，將稀釋后的血樣平鋪到分離液液面上方（分離液：稀釋全血=1：2），保持兩液面界面清晰。 

3）800g，室溫，離心 20min-30min（注：設(shè)置較慢的加速度和減速度，如果有十檔，設(shè)為第三檔）。 

4）離心結(jié)束后，吸棄血漿層，小心吸取PBMC層（即白膜層）并轉(zhuǎn)移至15mL離心管中。離心結(jié)束后，管內(nèi)液面從上至下依次為稀釋血漿層、PBMC層、分離液層和紅細(xì)胞層（見圖1）。 

圖1 稀釋外周血離心前后的分層狀態(tài)圖

5）向離心管中加入10mL 的1×稀釋洗滌液重懸細(xì)胞，250g，室溫離心 10min ，棄上清。重復(fù)該步驟 1~2 次，即可用于后續(xù)試驗(yàn)。

3     注意事項(xiàng)

1）不同種屬動物單個核細(xì)胞的比重有一定差異，請選擇合適的分離液進(jìn)行PBMC的分離。

2）血液新鮮程度是影響分離效果的關(guān)鍵因素，請盡量使用采集后24h內(nèi)的血液進(jìn)行PBMC分離。

3）為保證細(xì)胞的活力，整個操作過程請輕柔，避免對細(xì)胞造成機(jī)械性的損傷。

4）為保持細(xì)胞狀態(tài)良好，請盡量縮短整個試驗(yàn)的周期。

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