一、实验材料

1、样本来源：人脑组织（通常来源于手术切除的皮质灰质区域，需符合伦理规范）。

2、试剂

PBS（含青霉素100 U/ml和链霉素100 μg/ml）

胶原酶（1 mg/ml）和DNaseⅠ（10 μg/ml）混合消化液

250 g/L牛血清白蛋白（BSA）

基础培养基（如DMEM或特制培养基）

3、耗材

眼科剪、镊子

不同孔径尼龙筛（60 μm、150 μm、230 μm）

离心管（15 ml、50 ml）

二、实验步骤

1、组织处理

将人脑组织置于预冷的PBS中，去除脑膜及表面大血管，保留皮质灰质。

使用匀浆机将灰质组织制成匀浆，以释放微血管片段。

2、酶消化

加入含胶原酶和DNaseⅠ的消化液，37℃消化1小时，随后离心去除上清中的脂肪碎片和髓磷脂。

将沉淀重新悬浮于消化液中，继续消化1-3小时以充分解离微血管。

3、分级过滤

消化产物依次通过230 μm和150 μm尼龙筛，去除大血管和碎片。

滤液通过60 μm尼龙筛，收集截留的微血管内皮细胞，并用培养基冲洗至培养皿中。

4、纯化与培养

使用250 g/L BSA梯度离心（4000 rpm，10分钟）进一步纯化微血管内皮细胞。

将细胞重悬于含特制添加剂的培养基（如原代内皮细胞培养基），接种至多聚赖氨酸包被的培养板中，置于37℃、5% CO?培养箱中培养。

三、关键注意事项

样本新鲜度：人脑组织需尽快处理（建议在2小时内），避免细胞活性下降。

污染控制：严格无菌操作，并在PBS中添加抗生素防止微生物污染。

酶消化优化：胶原酶浓度和消化时间需根据组织特性调整，过长可能导致细胞损伤。

纯度验证：可通过免疫荧光染色鉴定内皮细胞纯度。

四、与动物模型方法的差异

组织处理：人脑组织通常更致密，需更长时间消化（动物模型多采用30-45分钟）。

筛网选择：动物模型多用离心法分层，而人源细胞依赖分级过滤。

培养基：人源细胞常需添加特制生长因子，而大鼠BMEC可用DMEM基础培养基。

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