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杭州實(shí)了個(gè)驗(yàn)生物科技有限公司
中級(jí)會(huì)員·2年
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熒光定量PCR（qPCR）是一種廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)分析、病原體檢測(cè)和基因分型的技術(shù)。羅氏LightCycler® 480是一款常用的熒光定量PCR儀，具有高靈敏度和穩(wěn)定性。以下為詳細(xì)操作步驟，供參考使用。
一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
儀器檢查
確認(rèn)LightCycler® 480主機(jī)、電腦及軟件處于正常工作狀態(tài)。
檢查加熱蓋是否清潔，避免污染或殘留物影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
確保電源連接穩(wěn)定，避免實(shí)驗(yàn)過(guò)程中斷電。
耗材與試劑準(zhǔn)備
DNA模板或cDNA
引物和探針（如TaqMan探針或SYBR Green染料）
聚合酶（如Taq DNA聚合酶）
dNTPs
緩沖液
使用兼容的PCR反應(yīng)板或毛細(xì)管（如96孔板或384孔板）。
準(zhǔn)備熒光定量PCR試劑，包括：
若使用探針?lè)?，需確認(rèn)探針與儀器檢測(cè)通道匹配（如FAM、HEX等）。
環(huán)境準(zhǔn)備
實(shí)驗(yàn)區(qū)域需清潔，避免氣溶膠污染。
建議在超凈臺(tái)或通風(fēng)櫥中配制反應(yīng)體系，減少外源DNA污染風(fēng)險(xiǎn)。
二、反應(yīng)體系配制
計(jì)算反應(yīng)體積
根據(jù)樣本數(shù)量和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，計(jì)算所需試劑總量（通常單反應(yīng)體積為10-20 μL）。
預(yù)留額外10%體積以補(bǔ)償移液誤差。
配制主混合液（Master Mix）
將除模板外的所有試劑（緩沖液、dNTPs、引物、探針、聚合酶等）混合，渦旋振蕩后短暫離心。
分裝至PCR板或毛細(xì)管中，避免產(chǎn)生氣泡。
加入模板
在單獨(dú)區(qū)域加入DNA或cDNA模板，避免交叉污染。
每孔模板體積需保持一致（如2-5 μL）。
設(shè)置陰性對(duì)照（無(wú)模板對(duì)照，NTC）和陽(yáng)性對(duì)照。
密封反應(yīng)板
使用光學(xué)密封膜覆蓋反應(yīng)板，確保密封性。
若使用毛細(xì)管，需檢查是否閉合。
三、程序設(shè)置與運(yùn)行
啟動(dòng)軟件
打開(kāi)LightCycler® 480軟件，選擇“New Experiment"創(chuàng)建新實(shí)驗(yàn)。
設(shè)置實(shí)驗(yàn)名稱(chēng)、保存路徑及用戶信息。
編輯程序
95℃ 10秒 → 65℃ 60秒 → 95℃連續(xù)升溫（0.1℃/秒）并采集熒光。
變性：95℃ 10-30秒
退火：50-60℃ 10-30秒（根據(jù)引物Tm值調(diào)整）
延伸：72℃ 10-30秒（視產(chǎn)物長(zhǎng)度而定）
預(yù)變性階段：95℃維持3-10分鐘，激活聚合酶。
擴(kuò)增循環(huán)（通常35-45個(gè)循環(huán)）：
熒光采集：在退火或延伸階段采集信號(hào)（根據(jù)染料類(lèi)型選擇單色或多色檢測(cè)）。
熔解曲線分析（僅SYBR Green法）：
板布局設(shè)置
在軟件中定義樣本位置，標(biāo)注對(duì)照孔和待測(cè)樣本孔。
選擇熒光通道（如FAM對(duì)應(yīng)通道1，HEX對(duì)應(yīng)通道2）。
運(yùn)行程序
將反應(yīng)板放入儀器，確認(rèn)放置平穩(wěn)。
點(diǎn)擊“Start"開(kāi)始運(yùn)行，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增曲線。
四、數(shù)據(jù)分析
基線調(diào)整
軟件自動(dòng)或手動(dòng)設(shè)置基線范圍（通常為前3-15個(gè)循環(huán)）。
確保擴(kuò)增曲線在閾值線（Threshold）附近呈現(xiàn)清晰的指數(shù)增長(zhǎng)。
閾值設(shè)定
手動(dòng)調(diào)整閾值線至指數(shù)增長(zhǎng)期上方，軟件自動(dòng)計(jì)算Ct值（循環(huán)閾值）。
結(jié)果解讀
定量分析：通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算模板濃度（絕對(duì)定量）或比較ΔΔCt值（相對(duì)定量）。
熔解曲線：SYBR Green法需檢查單峰（特異性擴(kuò)增）或多峰（引物二聚體或污染）。
排除異常值（如NTC出現(xiàn)擴(kuò)增提示污染）。
導(dǎo)出數(shù)據(jù)
保存實(shí)驗(yàn)文件，導(dǎo)出Ct值、熔解曲線等數(shù)據(jù)。
生成報(bào)告（PDF或Excel格式）。
五、實(shí)驗(yàn)后處理
儀器維護(hù)
關(guān)閉軟件和主機(jī)電源，清潔反應(yīng)槽及加熱蓋。
定期進(jìn)行校準(zhǔn)（如光學(xué)校準(zhǔn)或溫度校準(zhǔn)）。
耗材處理
廢棄反應(yīng)板按生物危害廢物處理。
毛細(xì)管需妥善丟棄，避免劃傷。
數(shù)據(jù)備份
將實(shí)驗(yàn)結(jié)果備份至云端或外部存儲(chǔ)設(shè)備。
六、常見(jiàn)問(wèn)題與解決方案
無(wú)擴(kuò)增信號(hào)
檢查試劑活性（如聚合酶是否失活）。
確認(rèn)引物探針設(shè)計(jì)正確，模板質(zhì)量合格。
非特異性擴(kuò)增
優(yōu)化退火溫度或更換引物。
增加模板稀釋度減少抑制物影響。
重復(fù)性差
檢查移液精度，確保反應(yīng)體系均一。
避免模板降解或污染。
注意事項(xiàng)
分區(qū)操作：模板添加與主混合液配制需在不同區(qū)域進(jìn)行。
避免頻繁打開(kāi)反應(yīng)板，防止氣溶膠污染。
定期驗(yàn)證儀器性能，確保數(shù)據(jù)可靠性。
以上為羅氏LightCycler® 480熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)操作流程，具體參數(shù)需根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膬?yōu)化。
