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杭州實(shí)了個(gè)驗(yàn)生物科技有限公司
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羅氏LightCycler® 480熒光定量PCR儀說(shuō)明書(shū)
一、儀器概述
羅氏LightCycler® 480熒光定量PCR儀是一種基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)的分子生物學(xué)檢測(cè)設(shè)備，用于核酸（DNA/RNA）的擴(kuò)增和定量分析。該儀器采用光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)，可在PCR擴(kuò)增過(guò)程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)變化，并通過(guò)軟件分析計(jì)算目標(biāo)核酸的初始濃度。
LightCycler® 480適用于醫(yī)學(xué)診斷、基礎(chǔ)研究、食品安全檢測(cè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域，支持多重PCR檢測(cè)，滿(mǎn)足不同實(shí)驗(yàn)需求。
二、儀器組成
1. 硬件部分
溫控模塊：采用Peltier半導(dǎo)體溫控技術(shù)，控溫范圍通常為4°C–99°C，升降溫速率可達(dá)4.8°C/秒（視具體型號(hào)）。
光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)：
激發(fā)光源：LED或鹵素?zé)簦ㄒ曅吞?hào)）。
檢測(cè)通道：通常支持4–6個(gè)熒光通道（如FAM、HEX、ROX、Cy5等），可同時(shí)檢測(cè)多種熒光信號(hào)。
樣本承載系統(tǒng)：兼容96孔板或384孔板（視型號(hào)），部分版本支持多模塊并行運(yùn)行。
觸摸屏控制面板（部分型號(hào)）：可直接進(jìn)行基本操作和程序設(shè)定。
2. 軟件部分
LightCycler® 480 Software：提供實(shí)驗(yàn)設(shè)置、數(shù)據(jù)采集、分析和報(bào)告生成功能。
支持絕對(duì)定量、相對(duì)定量、熔解曲線分析、基因分型等模式。
可導(dǎo)出數(shù)據(jù)至Excel、PDF等格式。
三、工作原理
實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）通過(guò)監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增過(guò)程中熒光信號(hào)的累積來(lái)定量目標(biāo)核酸。LightCycler® 480采用以下兩種主要檢測(cè)方式：
基于探針的檢測(cè)（如TaqMan探針）：探針與目標(biāo)序列結(jié)合后，在擴(kuò)增過(guò)程中被酶切，釋放熒光信號(hào)。
基于染料的檢測(cè)（如SYBR Green）：染料結(jié)合雙鏈DNA后發(fā)出熒光，但可能受非特異性擴(kuò)增影響。
儀器在每輪PCR循環(huán)后采集熒光信號(hào)，生成擴(kuò)增曲線，并通過(guò)閾值循環(huán)數(shù)（Ct值）計(jì)算初始模板量。
四、操作流程
1. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
樣本處理：提取DNA/RNA，測(cè)定濃度和純度（如A260/A280比值）。
試劑準(zhǔn)備：
選擇合適熒光標(biāo)記（探針或染料）。
配制PCR反應(yīng)體系（模板、引物、探針、酶、dNTPs、緩沖液等）。
耗材選擇：使用適配的96孔板或384孔板，避免氣泡影響信號(hào)檢測(cè)。
2. 儀器設(shè)置
開(kāi)機(jī)與初始化：
打開(kāi)儀器電源，啟動(dòng)軟件，進(jìn)行光學(xué)校準(zhǔn)（如需要）。
創(chuàng)建實(shí)驗(yàn)程序：
設(shè)定PCR循環(huán)參數(shù)（預(yù)變性、變性、退火/延伸、循環(huán)次數(shù)）。
選擇熒光檢測(cè)通道（如FAM、HEX）。
樣本排布：
在軟件中設(shè)定樣本位置，標(biāo)注標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣本、陰性/陽(yáng)性對(duì)照。
3. 運(yùn)行PCR
將反應(yīng)板放入儀器，啟動(dòng)運(yùn)行。
實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增曲線和熒光信號(hào)。
4. 數(shù)據(jù)分析
擴(kuò)增曲線分析：軟件自動(dòng)計(jì)算Ct值，生成標(biāo)準(zhǔn)曲線（絕對(duì)定量）或ΔΔCt值（相對(duì)定量）。
熔解曲線分析（如使用SYBR Green）：確認(rèn)擴(kuò)增特異性。
數(shù)據(jù)導(dǎo)出：保存或打印結(jié)果。
五、應(yīng)用領(lǐng)域
醫(yī)學(xué)診斷：
病原體檢測(cè)（如新冠病毒、HIV、HBV）。
遺傳病篩查（如地中海貧血、囊性纖維化）。
科研實(shí)驗(yàn)：
基因表達(dá)分析（qRT-PCR）。
SNP分型、突變檢測(cè)。
食品安全與農(nóng)業(yè)：
轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)。
食源性致病菌（如沙門(mén)氏菌、大腸桿菌）鑒定。
環(huán)境監(jiān)測(cè)：
水體或土壤中的微生物檢測(cè)。
六、注意事項(xiàng)
1. 實(shí)驗(yàn)優(yōu)化
引物/探針設(shè)計(jì)：確保特異性，避免二聚體或非特異性擴(kuò)增。
反應(yīng)體系優(yōu)化：調(diào)整Mg2?濃度、退火溫度等參數(shù)。
2. 防污染措施
分區(qū)操作（試劑配制區(qū)、樣本處理區(qū)、擴(kuò)增區(qū)）。
使用UNG酶（尿嘧啶-DNA糖基化酶）防污染體系。
3. 儀器維護(hù)
日常清潔：定期用無(wú)塵布擦拭樣本槽和光學(xué)部件。
校準(zhǔn)：定期進(jìn)行光學(xué)校準(zhǔn)和溫度驗(yàn)證。
避免長(zhǎng)時(shí)間高負(fù)荷運(yùn)行，以延長(zhǎng)設(shè)備壽命。
七、常見(jiàn)問(wèn)題與解決方案
| 問(wèn)題 | 可能原因 | 解決方法 |
|---|---|---|
| 無(wú)熒光信號(hào) | 試劑失效、探針降解 | 更換新鮮試劑，檢查探針質(zhì)量 |
| 擴(kuò)增曲線異常 | 模板降解、PCR抑制物 | 重新提取核酸，優(yōu)化純化步驟 |
| 重復(fù)性差 | 加樣誤差、溫度不均 | 使用排槍精確加樣，檢查溫控模塊 |
八、技術(shù)參數(shù)（以LightCycler® 480 II為例）
溫控范圍：4°C–99°C
升降溫速率：最高4.8°C/秒
檢測(cè)通道：6色熒光（FAM、HEX、ROX、Cy5等）
通量：96孔或384孔（視型號(hào)）
數(shù)據(jù)輸出：Ct值、熔解曲線、基因分型等
九、總結(jié)
羅氏LightCycler® 480熒光定量PCR儀通過(guò)高精度溫控和多重?zé)晒鈾z測(cè)，為核酸定量分析提供穩(wěn)定可靠的技術(shù)支持。其應(yīng)用范圍廣泛，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性依賴(lài)于合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、規(guī)范操作和定期維護(hù)。用戶(hù)應(yīng)根據(jù)具體需求選擇合適的檢測(cè)模式和耗材，并遵循標(biāo)準(zhǔn)化流程以確保數(shù)據(jù)可靠性。
