PriCells: 用Nycodenz○R不连续梯度溶液纯化酵母线粒体

试剂和器材： 
1. 酵母原生质体制备于山梨醇缓冲液中；
2. NycoprepTM Universal（600g/L Nycodenz）；
3. Nycodenz○R工作溶液：500g/L Nycodenz；
4. 山梨醇缓冲液：0.6mol/L山梨醇、20mmol/L Mes-KOH，pH6.0；
5. 山梨醇缓冲液（2×）：1.2mol/L山梨醇、40mmol/L Mes-KOH，pH6.0；
6. 悬浮缓冲液：0.6mol/L山梨醇、20mmol/L Mes-KOH，pH7.4；
7. 按要求向溶液加入蛋白酶抑制剂；
8. 高速离心机，配有8×50ml规格固定角转子；
9. 超速离心机，配有可容纳12—13ml管吊桶式转子；
10. Dounce匀浆器（约40ml紧密配制，Wheaton A型）；
11. Dounce匀浆器（约40ml宽松配制，Wheaton B型）；

实验方法：
   所有操作须在0—4℃下进行。
1. 使用紧致配制Dounce匀浆器用研杵研磨15次来匀浆原生质体；
2. 用等体积的山梨醇缓冲液稀释，并用固定角转子在1500g转速下离心5min；
3. 轻轻倒出上清液，并保留沉淀；
4. 用山梨醇缓冲液将沉淀重悬到原体积，再重复第1、2步操作；
5. 合并所有上清液，在12000g转速下离心10min；
6. 将粗制的线粒体沉淀在约40ml的山梨醇缓冲液中重悬，用宽松配制的Dounce匀浆器轻轻地研磨几次；
7. 1500g下离心5min，以去除剩余的核和碎屑；
8. 用带金属套管针的注射器将上清去除，当心不要搅到疏松堆积的沉淀；
9. 12000g将上清离心10min，在约4ml的山梨醇缓冲液中重悬沉淀（使用宽松配制的Dounce匀浆器）；
10. 从25ml山梨醇缓冲液（2×）和18ml（和14.5ml）500g/L Nycodenz工作溶液来制备两种180g/L和145g/L的Nycodenz溶液；用水将每种溶液配制到50ml；
11. 在适用于吊桶式转子的管中装入这些Nycodenz溶液各5ml以及约2ml的粗制线粒体混悬液（若有必要，用山梨醇缓冲液注满）；
12. 在约200000g下离心30min。纯化的线粒体在两种Nycodenz溶液界面上呈带；
13. 用带金属套管针的注射器收集区带；用4倍体积的悬浮缓冲液来稀释；12000g离心15min，在悬浮缓冲液中重悬沉淀；