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多特異性抗體可以設計成多種不同的形式。二十多年來在雙特異性抗體工程領域的研究和開發表明，抗體的設計和形式的選擇對抗體的功能有著深遠的影響。這尤其適用于引起細胞間生物學過程的反應，如受體激活、受體內化、受體聚集或在兩個細胞之間形成免疫突觸。為什么一些具有相同大小和結構域的形式比其他形式更有效？幾何結構的重要性不言而喻，TriFab是一種設計的抗體形式，由兩個腫瘤細胞靶向實體和一個T細胞結合部分組成，特點是其緊湊的形狀。TriFab與具有相同結構域序列的IgG樣分子相比，這種*的桶狀形狀使效價提高了35倍。

隨著重組蛋白表達技術和抗體工程技術的發展，產生了許多不同的抗體形式。的抗體結構取決于所期望的生物效應及其潛在的結構條件。多特異性抗體用于各種目的，包括（1）受體激活（2）阻斷（3）內化（4）聚集，（5）膜相關蛋白的結合，或（6）細胞毒性效應細胞的定向靶點（圖1）。在這些應用領域中，下面幾個例子證明了抗體形式對性能的影響。
受體激活并誘導下游信號轉導以達到一定的表型是激動劑抗體的目標。Shi等人提出一種IgG形狀，四價，雙翼形式，在每個N-端只包含VH結構域（圖2a）。近距離的抗體結合部位模擬了天然配體，從而激活內分泌成纖維細胞生長因子FGF21受體（FGFR）。這種*的抗體幾何結構是經過精心設計的，并被證明是激活受體的關鍵。近也報道有同樣形式的靶向CD40的激動劑抗體（圖2b）以及一種二價的Y形Surrobody，激活死亡受體DR4和DR5。這種分子顯示出比單一特異性DR4和DR5抗體更強的效力，這表明它具有*的激活機制。近，Genentech的抗體工程師設計了一種簡單的1+1IgG形式的分子（圖2c），通過MerTK（Mer酪氨酸激酶）受體途徑激活巨噬細胞，導致CD20陽性B細胞吞噬。

受體阻滯劑是目前腫瘤免疫治療方法的重要組成部分。以抑制性免疫檢查點為靶點的雙特異性拮抗分子在克服腫瘤逃避機制方面顯示出了很好的效果。一個突出的例子是免疫檢查點的雙重阻斷，如LAG-3和PD-1，它誘導抗腫瘤免疫。正在進行的多種雙特異性抗體形式的臨床試驗數量驚人。然而，相對于激動劑抗體的挑戰性（它們依賴于親和力和內在功效），設計阻斷抗體主要依賴于尋找與天然配體競爭的高親和力結合物，因此被認為并不太復雜。

抗體誘導的受體內化在抗體偶聯藥物（ADC）重定位中起重要作用。可以證明，與單價形式相比，EGFR的二價結合和由此引發的二聚作用導致受體-抗體復合物的內化顯著提高。Niewehner等人分析了實現血腦屏障跨細胞作用的不同形式。轉鐵蛋白受體（TfR）的一價靶向導致體內腦暴露比二價形式高55倍。據推測，二價TfR結合導致受體二聚化，并隨后進入溶酶體途徑。另一方面，單價結合可使轉鐵蛋白同時絡合，并將兩種分子共轉運至管腔的另一側，而不會使抗體降解。

受體聚集的一個例子是激活由腫瘤壞死因子受體超家族（TNFRSF）的受體介導的外源性凋亡途徑，例如死亡受體（DR）。誘導信號級聯反應的激動性抗體的產生非常具有挑戰性，在早期的方法中獲得的激動劑抗體臨床療效有限。Yang等人用四價雙翼抗體實現了穩定固有的激活，而二價雙翼的對照分子沒有觸發任何激活。Brunker等人設計了以腫瘤抗原FAP（成纖維細胞激活蛋白）和DR5為靶點的2+2形式。結果表明，這種形式在順式方向上的二價結合導致DR5親和力驅動的高聚集，并隨后表現出強誘導細胞凋亡的作用。與其他依賴FcγR相互作用的聚集方法不同，他們利用腫瘤間質中FAP的表達，有針對性地促進DR5的高聚集，從而降低FcγR依賴方法中的全身毒性。

另一個應用領域是抗體介導的磷脂膜上兩種或兩種以上蛋白質的結合。血友病A是一種由于凝血蛋白因子VIII缺失而引起的遺傳性出血性疾病。在生理條件下，FVIII作為輔助因子促進酶-底物復合物FIXa-FX的結合，從而激活FX，而FX又是凝血級聯反應的關鍵因素。來自Chugai的研究人員生成了一種IgG形狀的bsAb，其幾何形狀與FVIII的結構和變構特性相似，從而恢復了凝血級聯反應。這種分子被稱為Hemliba®（Emizizumab），是兩種經批準的bsAb之一。

細胞毒效應細胞靶向惡性組織的重定向是單克隆抗體的另一種作用方式。模擬抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC）可能是消除癌細胞的治療策略之一。這個概念的基礎是用治療性抗體靶向癌細胞，然后通過Fc受體與NK細胞結合。NK細胞的激活反過來導致靶細胞死亡。Fc受體（FcγRIII，CD16）介導的作為bsAb功能的招募可以通過NK細胞表面的CD16結合到bsAb的Fc區域來實現，或者通過結合腫瘤特異性抗原和CD16的bsAb來實現。在這兩種情況下，bsAb的組成和形式都會影響ADCC誘導的效果。用于Fc介導的NK細胞招募的bsAb的設計面臨著這樣一個挑戰：所選擇的形式需要確保Fc結構域對NK細胞CD16的有效結合。例如，單鏈抗體在N端或C端融合可顯示出誘導ADCC的不同能力，從保留活性到ADCC活性的喪失。這些效應很可能是由于添加了結合區域和/或結合靶抗原對FcγRIII與NK細胞相互作用的空間阻礙引起的，不僅取決于形式，還取決于靶抗原（和表位）的選擇，因此需要在個體基礎上進行實驗評估。通過與腫瘤細胞和CD16結合招募NK細胞的bsAb的ADCC效率同樣依賴于結合抗體和形式的選擇。例如，Reusch和他的同事已經證明，ADCC誘導的結合腫瘤相關抗原（TAA）CD30和CD16A的bsAb在雙CD16A結合的TandAb（串聯diabody）形式中比在diabody形式下的單價CD30/CD16A結合更優。

另一類特征明確且臨床相關的用于效應細胞重定位的bsAb是T細胞結合的衍生物，它們是癌癥免疫治療的中心支柱。在這個領域，Blincyto®（blinatumomab）是代表，在II期研究中，這種CD19/CD3雙特異性導致69%的復發/難治性B前體急性淋巴細胞白血病（ALL）患者緩解。

1985年證明T細胞雙特異性（TCB）的概念后，出現了新的抗體形式。乍一看，兩個細胞的交聯似乎相當簡單，不像前面提到的例子那樣依賴于形式。然而，在測試各種抗體的過程中，很明顯，設計安全有效的TCB不僅僅是一個即插即用的練習。例如，CD3結合抗體的高親和力被證明與抗體迅速滲入次級淋巴組織和較低的腫瘤穿透率有關。其他人報告在注射高親和力或二價CD3ε結合抗體后產生強烈的細胞因子釋放效應。幾何結構、價態和柔韌性也是影響T細胞招募治療雙抗的功能、效力和安全性的重要參數。

形式對T細胞接合雙抗很重要。但為什么重要？要回答為什么某些抗體結構顯示出比其他抗體更高的效力，就必須了解分子作用的生物學。

抗原呈遞細胞（APC）與T細胞之間的生理免疫突觸（IS）是T細胞活化的關鍵。在T細胞膜上，IS顯示為一個嵌套的環狀結構，常被稱為“bullseye"。中心區cSMAC（中央超分子激活簇）包含諸如T細胞受體（TCR）復合物、共刺激分子CD28、抑制免疫檢查點（如PD-1或CTLA-4）、信號介質如Lck（淋巴細胞特異性蛋白酪氨酸激酶）和PKC（蛋白激酶C），以及穿孔素等細胞毒性分子。cSMAC被周圍的SMAC（pSMAC）包圍，其中包含許多粘附分子，它們介導細胞-細胞的結合（如LFA1）。遠端環（dSMAC）包括抑制性酪氨酸磷酸酶CD45和動態肌動蛋白。APC和T細胞之間的膜距離約為13–15nm。試驗表明，一個拉長的膜間距降低了T細胞的活化，說明較近的距離是必須的，以適當地誘導T細胞活化。

今天，TCBs通過同時結合靶細胞上的TCR亞單位CD3ε和TAA來促進規則的細胞溶解免疫突觸的形成。Offner等人用共聚焦顯微鏡證明，在生理性和抗體誘導的人工突觸之間，來自所有SMAC環的突觸特異性標記的共定位沒有變化。Cartwright和他的同事利用定量熒光顯微鏡和納米級右旋糖酐來分析哪些分子大小可以進入IS，以及是否存在引發IS排斥的大小閾值。他們確定可以證明4到13nm范圍內的右旋糖酐可以穿透IS。另一方面，32-54nm之間的大分子被排除在外。他們的假設進一步被NK和腫瘤細胞之間免疫突觸大小不同的抗體所證實。這些發現表明，人工免疫突觸的距離很重要，在設計TCB時應該考慮到，TCB可能破壞而不是觸發突觸的形成。

Li和他的同事設計了一系列的TCB，這些TCB與FcRH5的不同區域結合，具有相似的結合親和力。選擇的表位位于靠近膜（近端）、遠離膜（遠端）或介于兩者之間。骨髓瘤細胞與人T細胞和抗體共培養表明，靶向近端表位可誘導*的IS，并導致T細胞活化和腫瘤細胞溶解。考慮到這一機制，他們可以證明去除抑制性磷酸酶CD45會觸發TCR磷酸化和T細胞信號的誘導。CD45是一種大的跨膜受體，其外結構域大小約為28-50nm。這反過來表明，較小的膜間距離有利于促進CD45從sSMAC中的清除。

Li等人分析了cSMAC內T細胞上的共抑制受體CTLA-4（細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白-4）與其結合伴侶B7相互作用的結構基礎。他們將細胞間的距離量化到14nm，這與其他人報道的免疫突觸的間距一致。這一點對于產生拮抗抗體也很重要。例如，研究小組猜測，抗CTLA-4拮抗劑tremelimumab通過增加細胞間隙至15-19nm來破壞CTLA-4和B7之間的抑制軸，這兩個受體就不能再相互作用了。

總的來說，人工免疫突觸是一個高度組織化的結構，與生理拓撲結構具有相同的特征。腫瘤和T細胞之間的膜間距的發現表明，抗體尺寸是突觸形成的一個關鍵參數。下圖總結了開發人工IS（是否抗體模擬了生理性膜間距）或未有效形成（在遠端表位結合或大抗體的情況下）的不同情況。

Wuellner等人比較了具有相同結合抗體和相同大小的兩種雙抗形式。種，FynomAb攜帶TAA結合抗體（即抗HER2 fynomer），N端融合到CD3的mAb上。在對照分子中，HER2結合抗體C端融合到Fc（圖3A）。因此，TAA和CD3ε結合端之間的分子距離相差10-12nm。在腫瘤細胞和T細胞的共培養分析中，N端融合的CD3ε結合雙抗誘導提高了20倍以上的效力（取決于靶細胞系，可以高達115倍），這表明TAA和TCR結合物之間的密切聯系是有利的。這些觀察結果與其他使用串聯單鏈抗體靶向不同表位從而改變膜間距離的研究一致。

在一項類似的未發表的研究中，janssen對不同的bsAb形式進行了體外殺傷試驗。在1+1格式中，CD3ε結合端位于一條重鏈上，而TAA結合端（centyrin）要么與Fc的C端融合，要么位于另一條重鏈上的相鄰鉸鏈區域。隨著TAA與CD3ε結合端之間距離的增大，近距離結構的的效價比遠距離高100倍。

近，Santich和他的同事解析了一個對稱的雙價bsAb，以探索價態和空間構型對bsAb誘導的T細胞毒性的重要性。他們使用單價腫瘤靶向IgG支架，將CD3ε靶向單鏈抗體以順式（TAA結合端的輕鏈）或反式取向（非靶向結合端的輕鏈）融合到C-末端，得到1+1 bsAb（圖3B）。他們可以證明順式取向的分子在體外和體內都比具有更大的域間距離的反式分子更有效。順式構型和短的結構域間距的有益增效其他人也有報道。重要的是，Santich等人強調進一步縮短結構域間距離通常是不利的，用2+2-BiTE-Fc分子進行的實驗表明，CD3ε與腫瘤細胞之間的物理約束或機械耦合受損，導致T細胞反應降低。

Moore和他的同事比較了DART（雙親和重靶向）抗體與傳統串聯單鏈抗體（例如blinatumomab）在腫瘤細胞清除方面的效力。兩種分子具有相同的分子量和相同的抗體序列。然而，這兩種形式的區別在于分子的幾何結構。在串聯結構中，兩個單鏈抗體一個接一個地位于一個鏈上，而DART分子在兩個鏈（VLA-VHB，VLB-VHA）上以交替順序攜帶兩個特異性的可變域。此外，該結構在C-端的鉸鏈區域中形成穩定的二硫鍵（圖3C）。DART格式被證明在細胞毒性分析中的效力高出60倍。此外，DART分子在T細胞和靶細胞之間誘導了三倍多的細胞-細胞結合。活性的增加被解釋為穩定的結構和支持雙細胞結合的生理幾何學。二硫鍵橋的另一個優點是增加了熱穩定性。

Asano和他的同事發表了多個研究，集中在TCB背景下結構域定向對抗體功能的影響。他們表達了以EGFR和CD3ε為靶點的雙特異性雙抗體的所有四種可能的結構域順序（圖3D）。雖然所有的分子都被證明具有與兩種TAA相似的結合能力，但腫瘤生長抑制作用卻有顯著差異。他們推測，由于其緊湊和不太靈活的結構，不同的diabody取向在細胞交聯過程中面臨不同的空間障礙，從而影響T細胞活性和隨后的效應器功能。另一項研究通過重新排列基于Fc的diabodies中的結構域也進行了類似的觀察，它們除了表現出不同的抗腫瘤作用外，還具有不同的抗降解性和體內半衰期。

Cheng等人研究了一種靶向黑色素瘤細胞的二唾液酸神經節苷脂（GD2）的TCB。他們觀察到串聯單鏈抗體形式的可變結構域方向（VH->VL或VL->VH）顯著影響與抗原的結合力以及腫瘤和T細胞存在時的細胞毒性效應。根據分子模型和抗原對接數據，證實了CDR環的關鍵殘基在VH和VL方向上具有不同的構象，這些殘基對抗原結合起著重要作用。

近發表了一種抗體形式，名為TriFab，其中Fc部分的CH2結構域被T細胞結合域取代。如圖4A所示，CD3ε結合端的可變區被并入抗體的主干區，而不是像在大多數TCB形式中發現的N-或C-末端融合。

另一種與TriFab和Contorsbody架構相關的新穎格式是“TriFab Contorsbody"。這個分子是由兩個鏈（圖4B）組成的三價分子（圖4C）。CD3ε結合基團呈反式排列。在與人PBMC共培養試驗中比較兩種TCB形式的療效，發現Contors TCB比TriFab形式活性高35倍（圖4D）。

在Contorsbody中，兩個靶向部分（藍色）更接近，這可能導致靶細胞膜上更高的局部聚集。因此，與規則的Y形IgG樣分子相比，TCR的同時反式結合將導致TCR更密集的聚集。這種活性的增加可以用permissive幾何模型解釋，該模型描述了由于細胞質CD3ε結構域的誘導結構改變，TCR聚集導致活化增強。

與IgG形狀的分子相比，Contorsbody結構更緊湊。Y形結構的回轉半徑約為6nm，而Contorsbody的回轉半徑約為3nm；將半徑除以2等于體積減小了8倍。正因為如此，Contorsbody可能更適合穿透IS。如Cartwright等人所述，這會導致更高的局部濃度。從而導致細胞毒性增強。

TriFab-Contorsbody格式不僅使兩個結合基團更加緊密地結合在一起，而且在理想的trans結構中提供了第三個結合基團。使CD3ε結合更容易，這使得T細胞和靶細胞可以同時有效結合。

到目前為止，兩種雙特異性抗體已經，然而，正在進行的臨床試驗可能預示著還有更多的雙特異性抗體。除此之外，兩種不同抗原的同時結合在許多不同的治療領域是相關的，不于從兩個現有的單一特異性抗體的聯合治療演變而來共同阻斷策略。設計和選擇合適的結合抗體形式組合對于生成具有所需功能的bsAb至關重要。實現這一目標沒有“標準程序"，而是必須根據潛在的生物學和結構條件逐個解決。

Blinatumomab的成功誘發了T細胞雙特異性抗體開發的熱潮。許多與T細胞有關的抗體以各種形式和幾何結構得到測試，很明顯，它們的效力和安全性各不相同。同時，通過顯微鏡和結晶學的研究，揭示了免疫突觸形成的結構基礎。結合這些知識和許多臨床試驗的結果，現在可以解釋為什么有些形式比其他形式更有效。這些經驗教訓將有助于設計安全有效的T細胞活化的雙特異性抗體。相信，未來基于結構優化設計的雙特異性抗體會越來越多地出現在臨床研究中。