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当前位置：> 供求商机> 10180ES50-动物组织直接PCR试剂盒 Animal Tissue Direct PCR Kit
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Cat#:10126 冰袋运输 &保存方式详见各组分 |
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动物组织直接PCR试剂盒 Animal Tissue Direct PCR Kit | |
使用手册V1.1
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本产品仅作科研用途！ 上海翊圣生物科技有限公司 ：4006-111-883 : order@yeasen.com | |
产品信息
产品名称 | 产品编号 | 规格 | 价格（元） |
Animal Tissue Direct PCR Kit 动物组织直接PCR试剂盒 | 10126ES50 | 50T | 326.00 |
Animal Tissue Direct PCR Kit 动物组织直接PCR试剂盒 | 10126ES70 | 200T | 1236.00 |
产品描述
动物组织直接PCR试剂盒是一种可直接对不同动物组织进行PCR扩增的试剂盒，适应性广、稳定性强。试剂盒中采用*的裂解缓冲液体系，可以简便快速的裂解多种动物组织样品并释放出基因组DNA。整个过程不需要除去蛋白、RNA及其它次生代谢物，也无需有机溶剂抽提，即可得到质量稳定的基因组DNA，无需后续纯化步骤即可直接用于PCR反应。而且样品需求量小，少到5mg动物组织即可进行实验。
试剂盒中提供的 2×Tissue Master Mix 具有很强的扩增兼容性，能直接以待测样品裂解液为模板，进行高效特异性扩增。该试剂为2倍浓缩PCR反应混合物，包含了用于PCR扩增除模板和引物外的所有组分，并以dUTP替代了dTTP，另外加入了能够降解含有dUTP 模板的 UNG 酶(Uracil-N-glycosylase)。在PCR反应前，利用UNG酶降解含有尿嘧啶的PCR产物，UNG 酶对不含有尿嘧啶的模板不会造成任何影响，从而保证扩增的特异性和准确性，防止了大规模基因检测时可能出现的PCR产物污染问题。优化的2×Tissue Master Mix与直接裂解液配合使用能够快速简便地对样品进行检测，并具有灵敏度高、兼容性强、特异性强、稳定性好等特点。
该试剂盒可用于转基因型鉴定、动物基因分型等多种大规模基因检测。
产品组分
编号 | 组分 | 产品编号/规格 | 储存 | |
10180ES50（50T） | 10180ES70（200T） | |||
10180-A | 2 × Tissue Master Mix* | 500 μl | 1 ml×2 | -20℃ |
10180-B | Buffer AL | 5 ml | 20 ml | 室温或4℃ |
10180-C | Protease | 220 μl | 880 μl | 4℃ |
10180-D | 6× DNA Loading Buffer | 1.5ml | 1.5ml | 4℃ |
*2 × Tissue Master Mix中包含Tissue Taq DNA 聚合酶、UNG酶、dNTP（dUTP替代了dTTP）、MgCl2、反应缓冲液、PCR反应增强剂、优化剂和稳定剂。
运输方法
冰袋（wet ice）运输。
保存方法
① 本试剂盒的10180-A【2×Tissue Master Mix】保存在-20℃，避免反复冻融。
② 10180-B【Buffer AL】在常温干燥条件下，可保存12个月，如需保存更长时间可置于4℃。
③ 10180-C【Protease】溶液具有*配方，常温保存（25℃）可长期具有活性，在4℃保存，其活性和稳定性会更好，因此建议将其置于在4℃保存，请勿置于-20℃保存。
注意事项
1）本试剂盒适用于常规PCR，请勿用于多重PCR鉴定；建议扩增片段在1kb以内。
2）注意实验用具的清洁以及实验的操作手法，避免样本间的交叉污染。
3）建议采用新鲜采取的动物组织，若为长期冷冻组织，应尽量避免反复冻融，否则会导致模板的降解，影响PCR效率。
4）Buffer AL若低温保存，容易产生沉淀。在使用前务必将其在室温中放置一段时间，也可在37℃水浴中预热10min，以溶解沉淀，混匀后再使用。
5）电泳检测时，切勿使用含有 SDS 的 Loading Buffer，否则在电泳时会在泳道中出现一大团拖尾亮带，影响实验结果。
6）建议设立阳性及阴性对照反应。阳性对照可用50ng纯化的动物DNA为模板，阴性反应以ddH2O为模板，引物可采用以前成功扩增的引物。
7）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
操作方法
1. 取5-10mg动物材料，置于离心管中。尽量剪碎动物材料，以使之后的酶解反应容易进行。
2. 取100μl Buffer AL并加入4μl Protease，涡旋混匀。
3. 向混合液中加入动物组织，涡旋混匀。
4. 65℃孵育10-30min，然后95℃处理5min。
【注】：65℃孵育，一般只需10min即可满足多数PCR需求。若需要的DNA量较大或样品较难酶解，可以将时间延长至30min。组织块不需*酶解，残余的部分在后续离心步骤中可被除去。
5. 12,000 rpm (~13,400×g )离心5min。
6. 转移上清至新的离心管，4℃或-20℃放置备用或直接用于PCR扩增。
【注】：用于后续PCR检测时，模板量占PCR体系的1-10%之间，不能超过20%。如50μl 的PCR体系中，加入0.5-5μl 裂解液即可，但不能超过10μl。
7. PCR反应体系配制*
按照下表配制PCR反应体系，配置好反应体系后，短暂涡旋充分混匀并瞬时离心，将所有试剂收集到管底。
ddH2O | Up to 20μl |
2 × Tissue Master Mix | 10μl |
正向引物（10μM） | 0.5μl |
反向引物（10μM） | 0.5μl |
模板 DNA | xμl |
【*】：① 配制的PCR反应体系可根据所需终体系（如50μl）按照该比例进行调整。
② 通常引物终浓度为0.2-0.25μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.1-0.5μM范围内调整引物浓度。
8. PCR反应条件设置
此表PCR反应条件仅供参考。PCR反应条件因模板、引物等的结构条件不同而各异。具体操作中需要根据模板类型、目的片段大小、扩增片段的碱基序列和引物的GC含量及长短等具体情况来优化的反应条件，包括退火温度，延伸时间等。
循环步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
UNG酶处理 | 50℃ | 5min | 1 |
灭活UNG酶&预变性 | 94℃ | 5min | 1 |
变性 | 94℃ | 10sec | 30-40循环 |
退火a | 50-65℃ | 20sec | |
延伸b | 72℃ | 30 sec/kb | |
*延伸 | 72℃ | 5min | 1 |
【注】：a. PCR程序中的退火温度需根据引物的Tm值自行设置；
b. 延伸时间需要根据片段的长度来确定，对于1kb以内的DNA片段，建议延长时间为30sec。
常见问题与解答
常见问题 | 分析原因 | 解决方式 |
阳性对照、待测样本均无条带 | PCR反应体系或反应条件不合适。 | 使用梯度PCR 摸索反应条件。 |
PCR 试剂保存不当失去活性。 | 2 × Tissue Master Mix应保存于-20℃，使用时避免反复冻融。若使用频繁，可在4℃短时间存放。确保在10天内用完。 | |
引物设计问题。 | 尝试重新设计引物进行检查。 | |
阳性对照有目的条带，待测样本无条带或条带弱 | 加入组织裂解液过量。 | 增大反应体系，或减少裂解液的用量。 |
样本裂解混合液保存不当或保存时间过久，DNA基因组已被降解。 | 裂解混合液液可于4℃保存 2-3 天，尽量使用新鲜制备的裂解混合液进行 PCR。 | |
模板加入量不适合。 | 在反应体系 10-20%范围内优化模板加入量。反应效性能较差时，可以将模板浓度调节到低于10%的范围。 | |
PCR 循环数不足。 | 适当增加 PCR 的循环数，35-40 循环为佳。因为模板复杂，一般PCR反应要比用纯化的 DNA 模板多 5-10 个循环为佳。 | |
非特异性扩增 | 退火温度偏低。 | 适当提高退火温度?；蚨酝嘶鹞露茸鲆桓鎏荻让鳌?/span> |
PCR 循环数过多。 | 适当降低循环次数，推荐在 35-40 循环为佳。 | |
引物浓度偏高。 | 适量降低引物用量。通常引物终浓度为 0.2μM 可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.1-0.5μM 范围内调整引物浓度。 | |
模板加入量过多。 | 将模板加入量控制在10-20%。反应效性能较差时，可以降模板浓度调节到低于 10%的范围。 | |
空白对照出现目的条带 | 操作工具或试剂污染。 | 实验所有试剂或器材均应高压灭菌。操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。 |
样本间交叉污染。 | 每个取样器只对一个样本使用；或取完一个样本后，将取样器刃口浸入 2%的次氯酸钠溶液中，反复涮洗，然后用干净的纸巾擦干残液。 |
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