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翌圣生物科技（上海）股份有限公司
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产品简介
| 供货周期 | 现货 | 应用领域 | 医疗卫生,制药/生物制药 |
|---|
产品介绍
产品简介
Hifair® Advanced One Step RT-qPCR SYBR Green Kit是一款基于SYBR Green I染料进行荧光定量的试剂盒。使用基因特异性引物，反转录和qPCR反应在一管内完成，无需反复的开盖和移液操作，大大提高了检测效率，并降低了污染的风险。对于RNA样本，试剂盒采用耐热Hifair® V Reverse Transcriptase高效合成cDNA，同时采用UNICON® HotStart Taq DNA Polymerase进行定量扩增。在优化的缓冲体系下，该试剂盒的检测灵敏度针对高表达的靶标, 可以检至0.1 pg，中等表达的靶标，可以检至1 pg。该试剂盒同时也适用于DNA样本的扩增定量。该试剂盒可实现不同动植物样本、细胞、微生物核酸的高灵敏检测和定量。
产品信息
货号 | 11175ES20 / 11175ES70 |
规格 | 20 T / 200 T |
组分信息
组分编号 | 组分名称 | 11175ES20 | 11175ES70 |
11175-A | 2× Hifair® Advanced SG Buffer | 250 μL | 2×1.25 mL |
11175-B | Hifair® Advanced UH Enzyme Mix | 20 μL | 200 μL |
11175-C | RNase free H2O | 250 μL | 2×1.25 mL |
储存条件
-25~-15℃避光储存，有效期1年。
使用说明
推荐反应体系
组分 | 体积（μL）**** | 体积（μL） | 终浓度 |
12.5 | 25 | 1× | |
Hifair® Advanced UH Enzyme Mix | 1 | 2 | - |
Forward Primer (10 μM)** | 0.5 | 1 | 0.2 μM |
Reverse Primer (10 μM)** | 0.5 | 1 | 0.2 μM |
模板 RNA*** | X | X | |
RNase-free ddH2O | to 25 | to 50 |
表1反应体系*****
** 通常引物终浓度为0.2 μM，也可根据情况在0.1-1 μM之间进行调整。
*** 该试剂灵敏度，Total RNA在1 pg – 1 μg，人源样本测试显示最佳投入量为1 pg – 100 ng，控制Ct值整体在15-30之间为宜。
**** 推荐使用20 μL或 50 μL，以保证目的基因扩增的有效性和重复性。
***** 请于超净工作台内配制，并使用无核酸酶残留的枪头、反应管；推荐使用带滤芯的枪头。避免交叉污染和气溶胶污染。
反应程序
循环步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
反转录 | 50℃* | 6 min | 1 |
预变性 | 95℃ | 5 min | 1 |
扩增反应 | 95℃ | 15 sec | 40 |
60℃** | 30 sec | ||
熔解曲线 | 仪器默认设置 | 1 | |
表2 标准扩增程序
* 反转录温度可根据实验需求在50-55℃之间进行选择。对于DNA样本，反转录过程可省去。
** 特殊情况下退火/延伸温度可根据引物Tm值进行调整，建议使用60℃。
3. 适用机型
不需要Rox校正的仪器型号：
Bio-Rad: CFX96, CFX384, iCycler iQ, iQ5, MyiQ, MiniOpticon, Opticon, Opticon 2, Chromo4;
Eppendorf: Mastercycler ep realplex, realplex 2 s;
Qiagen: Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000;
Roche Applied Science: LightCycler 480, LightCycler2.0, Lightcycler 96;
Thermo Scientific: PikoReal Cycler; Cepheid: SmartCycler; Illumina: Eco qPCR;
Low Rox适用机型： ABI 7500, 7500 Fast, ViiA7, QuantStudio 3 and 5, QuantStudio 6, 7, 12k Flex;
Stratagene MX3000P, MX3005P, MX4000P;
High Rox适用机型： ABI 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT Fast, StepOne, StepOne Plus.
4. 引物设计技巧
1）引物最好应设计成跨越一个外显子-外显子连接，其中一条扩增引物可以潜在地跨越实际外显子-内含子边界。这种设计可以减少从污染的基因组DNA中扩增到假阳性的风险。
2）引物应具有特异性。引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。
3）引物长度一般在18~27 bp，不应过长否则导致其延伸温度过高，不适于Taq DNA 聚合酶反应。
4）引物GC含量在40%~60%，GC含量过高或过低都不利于反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。可按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估算引物的Tm值，也可以通过软件计算引物Tm值。
5）PCR产物的长度通?？刂圃?0-300 bp,为了保证扩增效率，在设计引物时要考虑PCR产物的长度。
6）引物3′端末端尽量避免为A，引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。
7）碱基要随机分布，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。
8）引物自身及引物之间避免存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′ 端的互补重叠以防止引物二聚体的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其DG值不要过高（应小于4.5 kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。
5. 异常结果分析
无Ct值出现
采集荧光信号的步骤有误：在退火/延伸结束采集信号；
引物降解：可通过PAGE电泳检测其完整性；
模板量不足：对未知浓度的样品应从原液开始测试；
模板降解：避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
Ct值偏大 (Ct >35)
扩增效率低：反应条件不够优化，引物设计存在问题，可试用三步法进行反应，也可适当降低退火温度等；
PCR产物太长：一般采用80-150bp的产物长度。
3) 标准曲线线性关系不佳
a. 加样存在误差：使得标准品不呈梯度；RNA模板推荐使用1×TE缓冲液（Cat #60143ES）进行梯度稀释，DNA模板推荐使用ddH2O稀释;
b. 标准品出现降解：应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品；
c. 引物设计不佳：重新设计引物；
d. 模板中存在抑制物，或模板浓度过高。
4) NTC有扩增（Ct<32）
a. 引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现；
b. 引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比；
c. 气溶胶污染：扩增产物泄露很容易在实验室中引发气溶胶污染，一旦污染，定量检测结果就会不准确。推荐使用DNA/RNA Remover 核酸气溶胶污染清除剂（Cat #19702ES）。
注意事项
1. 本产品仅作科研用途。
2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
3. 加样和配液步骤都尽量在冰上操作。
4. 每个组分在使用前都应震荡混匀，低速离心。
