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产品简介
| 供货周期 | 现货 | 货号 | 10187ES70 |
|---|---|---|---|
| 应用领域 | 生物产业 |
产品介绍
Plant Tissue Direct PCR Kit (With Dye)
植物组织直接pcr试剂盒
产品信息
产品名称 | 产品编号 | 规格 | 价格（元） |
Plant Tissue Direct PCR Kit (With Dye) | 10187ES50 | 50 T | 393.00 |
Plant Tissue Direct PCR Kit (With Dye) | 10187ES70 | 200 T | 1353.00 |
产品描述
植物组织直接pcr试剂盒是一款可直接对不同类型植物叶片和种子进行PCR扩增的试剂盒，适应性广、稳定性强。试剂盒采用*的裂解缓冲液体系，可以快速的裂解多种植物样品并释放出基因组DNA，不需要除去蛋白、RNA或次生代谢产物等，即可将释放出的基因组DNA作为模板直接用于PCR反应。此外，样品使用量少，低至1 mm植物叶片或种子即可进行实验。
本试剂盒中提供的2× Plant Master Mix具有很强的扩增兼容性，能直接以待测样品裂解液为模板，进行高效特异性扩增。该试剂为2倍浓缩PCR反应混合液，包含了用于PCR扩增除模板和引物外的所有组分，大大简化操作过程，降低污染几率。
该试剂盒可用于转基因植株鉴定、植物基因分型等。
产品组分
类别 | 编号 | 组分 | 产品编号/规格 | 储存 | |
10187ES50（50 T） | 10187ES70（200 T） | ||||
Part I | 10187-A | Buffer P1 | 1.25 mL × 2 | 5 mL × 2 | 4℃ |
10187-B | Buffer P2 | 500 μL | 1 mL × 2 | 4℃ | |
Part II | 10187-C | 2× Plant Master Mixa | 500 μL | 1 mL × 2 | -20℃ |
a）2× Plant Master Mix：包含热启动Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、MgCl2、反应缓冲液、PCR反应增强剂、优化剂以及稳定剂等，同时包含电泳Loading Buffer, PCR完成之后可直接电泳。
运输方法
冰袋运输。
保存方法
1. 试剂10187-A【Buffer P1】，置于4℃保存。
2. 试剂10187-B【Buffer P2】，中和裂解产物，利于更长时间保存样本，置于4℃保存。
3. 试剂10187-C【2 × Plant Master Mix】，-20℃保存，避免反复冻融。
操作方法
植物叶片
研磨裂解法：
①研磨仪破碎：将直径5 mm左右的叶片置于50 μL Buffer P1中，用研磨仪加钢珠（钢珠直径3mm左右，共2个）破碎叶片（45 Hz，1 min），叶片破碎后溶液呈现绿色，瞬时离心，上清液请放在4℃备用，取1 μL用于PCR扩增。
②枪头捣碎：推荐使用幼嫩叶片。将直径5 mm左右的叶片置于50 μL Buffer P1中，用枪头将叶片捣碎，捣碎后溶液呈现绿色，瞬时离心，上清液请放在4℃备用，取1 μL用于PCR扩增。
加热裂解法：推荐使用幼嫩叶片。将直径5 mm左右的叶片置于50 μL Buffer P1中，95℃加热5-10 min（确保裂解液*浸没叶片），较难裂解的叶片（老叶片）可适当延长时间（10-20 min），加热裂解后溶液呈现绿色，震荡混匀，瞬时离心，上清液请放在4℃备用，取1 μL用于PCR扩增。
直接法：推荐使用幼嫩叶片。使用打孔器或者刀，将直径1 mm左右的叶片直接加入到PCR反应体系中；复杂样本或者是长片段的扩增，推荐使用直径<1mm的叶片。
植物种子
加热裂解法：用刀或者坚硬的物体取直径约1 mm左右的种子，将其置于50 μL Buffer P1 中95℃加热5-10 min，较难裂解的种子可适当延长时间（10-20 min），加热后震荡混匀，瞬时离心，底部呈现透明的糊状，上清液请放在4℃备用，取1 μL上清液用于PCR扩增。
直接法：用刀或者坚硬的物体取直径约1 mm左右的种子，将其置于50 μL Buffer P1（Buffer P1需要提前室温下平衡20 min）中，用枪头或者其他的方式捣碎种子，种子捣碎后溶液呈现乳白色，室温静置15 min，震荡混匀，瞬时离心，上清液请放在4℃备用，取1 μL上清液用于PCR扩增。
PCR反应体系
组分 | 体积（μL） | 体积（μL） | 终浓度 |
2× Plant Master Mix | 10 | 25 | 1× |
Forward Primer (10 μM) | 0.5 | 1 | 0.2-0.25 μM |
Reverse Primer (10 μM) | 0.5 | 1 | 0.2-0.25 μM |
裂解产物（DNA模板） | 1 | 2 | - |
ddH2O | To 20 | To 50 | - |
【注】：各组分使用前应充分混匀。
a）模板加入量：小于PCR反应体系的5%，过多会严重抑制PCR反应，强烈推荐加入1 μL模板。叶片直扩优先推荐研磨仪裂解法，种子直扩优先推荐加热法。
b）引物终浓度：0.2-0.25 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可在0.1-0.5 μM范围内调整引物浓度。
c）反应体系：推荐使用20 μL或50 μL，以保证目的基因扩增的有效性和重复性。
d）体系配制：配制好PCR反应体系，置于涡旋仪上涡旋混匀，瞬时离心将反应液集于管底。
e）对照反应：建议进行PCR时，设置阳性和阴性PCR对照反应以便于排除假阳性或假阴性的干扰。
f）为了更稳定的保存裂解后的模板，将转移出来的上清液，按照裂解产物（DNA模板）：Buffer P2 = 5:1的比例混合，混匀后-20℃保存，稳定保存随时间和样本状态不同而有所不同。如果处理后的植物叶片或种子上清液一周内用于PCR扩增，不用加Buffer P2，上清液请保存在-20℃。
PCR反应条件
循环步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
预变性 | 94℃ | 5 min | 1 |
变性 | 94℃ | 10 sec | 35 |
退火 | 50-65℃ | 20 sec | |
延伸 | 72℃ | 1 min | |
终延伸 | 72℃ | 5 min | 1 |
【注】：a）退火温度：请参考引物的理论 Tm 值，退火温度可设置低于引物理论值 2-5℃。
b）延伸时间：需要根据片段的长度来确定，对于1 kb以内的DNA///片段，建议延长时间为1 min。
注意事项
1. 做叶片实验时，建议使用新鲜采取的叶片组织，若为长期冷冻组织，需-80℃保存，应尽量避免反复冻融，以免造成模板降解，影响PCR效率。叶片组织以幼嫩为宜，若为成熟的叶片，避免使用叶片主脉部位组织；做种子实验时，不要用发霉的种子，发霉的种子很可能导致试验失败。
2. 建议扩增片段长度1 kb以内，以便扩增效率///佳。
3. 取样时使用打孔器或者刀取适宜大小的样本，样本不同时，打孔器或者刀每次处理样本前需清洗干净。
4. 对于叶片组织，建议取1-10 mm的叶片，过小会使PCR扩增产量低，过多会抑制PCR反应，采用加热裂解法、枪头捣碎、研磨仪破碎的方式处理植物叶片，处理后需震荡离心，务必取上清液试验，沉淀会严重抑制PCR反应；对于种子组织，取1-3 mm的种子，过小会使PCR扩增产量低，过多会严重抑制PCR反应，采用加热裂解法裂解种子，处理后震荡离心，务必取上清液试验，沉淀会严重抑制PCR反应。
5.为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
常见问题与解决方法
常见问题 | 可能原因 | 解决方法 |
阳性对照、待测样本均无条带。 | PCR反应体系或反应条件不合适。 | 使用梯度PCR摸索PCR///佳反应条件。 |
PCR试剂保存不当失去活性。 | 2× PCR Mix应保存于-20℃，使用时避免反复冻融。若使用频繁，可在4℃短时间存放。 | |
引物设计问题。 | 尝试重新设计引物进行检查。 | |
阳性对照有目的条带，待测样本无条带或条带弱。 | 裂解液、中和液加入比例不当，裂解混合液影响PCR体系的pH值。 | 正常条件下，中和后的裂解混合液的 pH 应该在7-8左右(裂解产物和Buffer P2严格按照5:1的量进行中和)。 |
样本裂解混合液保存不当或保存时间过久，DNA基因组已经降解。 | 裂解混合液液可在4℃保存5天，尽量使用新制备的裂解液混合液进行PCR。 | |
模板加入量不适合。 | 在反应体系<5%范围内优化模板加入量。 | |
PCR循环数不足。 | 适当增加PCR的循环数，推荐35-40循环为佳。因模板复杂，一般PCR反应要比用纯化的DNA模板多5-10个循环为佳。 | |
非特异性扩增 | PCR退火温度太低，循环数、引物浓度或模板浓度太高。 | 增加PCR退火温度，降低PCR循环数、引物浓度或模板浓度。 |
PCR引物错配。 | 重新设计PCR引物。 | |
配制PCR反应体系时温度太高或配制完成后放置时间太久。 | PCR反应体系的配制在低温下进行，配制完成后尽快进行PCR扩增反应。 | |
阴性对照出现目的条带 | 操作工具或试剂污染。 | 实验所有试剂或器材均应高压灭菌。操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。 |
样本间交叉污染。 | 每个取样器只对一个样本使用；或取完一个样本后，将取样器刃口浸入2%的次氯酸钠溶液中，反复涮洗，然后用干净的纸巾擦干残液。 |
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