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翌圣生物科技（上海）股份有限公司
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产品简介
| 供货周期 | 现货 |
|---|
产品介绍
Plant Tissue Direct PCR Kit
植物组织直接PCR试剂盒
产品信息
产品名称 | 产品编号 | 规格 |
Plant Tissue Direct PCR Kit | 10183ES50 | 50 T |
Plant Tissue Direct PCR Kit | 10183ES70 | 200 T |
产品描述
植物组织直接PCR试剂盒是一款可直接对不同类型植物叶片进行PCR扩增的试剂盒，适应性广、稳定性强。试剂盒采用*的裂解缓冲液体系，可以快速的裂解多种植物样品并释放出基因组DNA，不需要除去蛋白、RNA或次生代谢产物等，即可将释放出的基因组DNA作为模板直接用于PCR反应。此外，样品使用量少，低至1 mg植物叶片即可进行实验。
本试剂盒中提供的2× Plant Master Mix具有很强的扩增兼容性，能直接以待测样品裂解液为模板，进行高效特异性扩增。该试剂为2倍浓缩PCR反应混合液，包含了用于PCR扩增除模板和引物外的所有组分，大大简化操作过程，降低污染几率。
该试剂盒可用于转基因植株鉴定、植物基因分型等。
产品组分
类别 | 编号 | 组分 | 产品编号/规格 | 储存 | |
10183ES503（50 T） | 10183ES70（200 T） | ||||
Part I | 10183-A | Buffer P1 | 3 mL | 10 mL | 室温或4℃ |
10183-B | Buffer P2 | 3 mL | 10 mL | 4℃ | |
10183-C | 6× DNA Loading Buffera | 1.5 mL | 1.5 mL | 4℃或-20℃ | |
Part II | 10183-D | 2× Plant Master Mixb | 500 μL | 1 mL×2 | -20℃ |
a）6× DNA Loading buffer：不含SDS。
b）2× Plant Master Mix：包含热启动Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、MgCl2、反应缓冲液、PCR反应增强剂、优化剂以及稳定剂等。
运输方法
冰袋运输。
保存方法
1. 试剂10183-A【Buffer P1】，在常温干燥条件下，可保存12个月，如需保存更长时间可置于4℃。低温保存，易出现沉淀，可平衡至室温或37℃水浴10 min，待沉淀溶解后，混匀使用。
2. 试剂10183-B【Buffer P2】，中和裂解产物，使其不影响后续 PCR 反应。保存条件与Buffer P1一样。
3. 试剂10183-C【6× DNA Loading Buffer】，可置于4℃或-20℃长期保存。
4. 试剂10183-D【2× Plant Master Mix】，-20℃保存，避免反复冻融。如果环境温度过高，2× Plant Master Mix 可能会变浑浊，可置于冰上放置1-2 min，待溶液澄清，上下颠倒混匀3-5次后再使用。
操作方法
本试剂盒根据不同实验需求提供了两种操作方法。直接法仅需要将一小片植物组织加入PCR反应体系即可；裂解法则是将少量含有植物组织的裂解产物加入PCR反应体系。其中，裂解法适合目的片段较长，扩增难度较大，以及需要对同一样本进行多次PCR扩增的实验。
裂解法
1. 取3-5 mg叶片（直径5-7 mm）组织，置于200 μL或1.5 mL离心管中。
【注】：切勿加入过量叶片组织，以便酶解反应更顺利进行。
2. 在离心管中加入50 μL Buffer P1，确保裂解液能够*浸没叶片组织。
3. 盖好离心管盖，95℃处理10 min。
【注】：加热后，若管壁上液体较多，可进行短暂瞬时离心。
4. 加入50 μL Buffer P2，用微量移液器吹打或者涡旋混匀。
5. 所得裂解液可4℃保存（5天）或-20℃长期保存或直接用于PCR扩增。
直接法
1. 在200 μL离心管中加入相应的2× Plant Master Mix，再添加对应的引物，并用ddH2O使其稀释1×（PCR体系配置见下表）
2. 剪取1-2 mg叶片碎块（直径2-3 mm）加入配置好的1×PCR反应体系。
【注】：确保叶片碎块*被PCR反应液浸没，切勿加入过量组织叶片。
3. 根据优化好的PCR条件（退火温度等）进行PCR反应。
4. 琼脂糖凝胶电泳检测结果。
【注】：建议使用试剂盒提供的6× DNA Loading Buffer，切勿使用含有SDS的Loading Buffer进行电泳。
PCR反应鉴定——PCR反应体系
组分 | 体积（μL） | 体积（μL） | 终浓度 |
2× Plant Master Mix | 10 | 25 | 1× |
Forward Primer (10 μM) | 0.5 | 1 | 0.2-0.25 μM |
Reverse Primer (10 μM) | 0.5 | 1 | 0.2-0.25 μM |
裂解产物（DNA模板） | 4 | 10 | - |
ddH2O | To 20 | To 50 | - |
【注】：各组分使用前应充分混匀。
a）模板使用量：建议10-20%总体系。避免超过总体系的30%。
b）引物终浓度：0.2-0.25 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可在0.1-0.5 μM范围内调整引物浓度。
c）反应体系：推荐使用20 μL或50 μL，以保证目的基因扩增的有效性和重复性。
d）体系配制：配制好PCR反应体系，置于涡旋仪上涡旋混匀，瞬时离心将反应液集于管底。
e）对照反应：建议进行PCR时，设置阳性和阴性PCR对照反应以便于排除假阳性或假阴性的干扰。
PCR反应鉴定——PCR反应条件
循环步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
预变性 | 94℃ | 5 min | 1 |
变性 | 94℃ | 10 sec | 30-40 |
退火 | 50-65℃ | 20 sec | |
延伸 | 72℃ | 30 sec/kb | |
终延伸 | 72℃ | 5 min | 1 |
【注】：a）退火温度：请参考引物的理论 Tm 值，退火温度可设置低于引物理论值 2-5℃。
b）延伸时间：需要根据片段的长度来确定，对于1 kb以内的DNA片段，建议延长时间为30 sec。
注意事项
1. 本试剂盒只适合于多糖多酚含量低的植物叶片样本，如小麦、水稻、烟草、玉米、大豆、油菜等。不适合多糖多酚含量高的植物样本。
2. 建议使用新鲜采取的叶片组织，若为长期冷冻组织，应尽量避免反复冻融，否则会导致模板的降解，影响PCR效率。叶片组织以幼嫩为宜，若为成熟的叶片，避免使用叶片主脉部位组织。
3. 电泳检测时，切勿使用含有SDS的Loading Buffer。否则，电泳时会在泳道中出现一大团拖尾亮带，影响实验结果。
4. 建议扩增片段长度1 kb以内，以便扩增效率*。
5. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
常见问题与解决方法
常见问题 | 可能原因 | 解决方法 |
阳性对照、待测样本均无条带。 | PCR反应体系或反应条件不合适。 | 使用梯度PCR摸索PCR*反应条件。 |
PCR试剂保存不当失去活性。 | 2× PCR Mix应保存于-20℃，使用时避免反复冻融。若使用频繁，可在4℃短时间存放。 | |
引物设计问题。 | 尝试重新设计引物进行检查。 | |
阳性对照有目的条带，待测样本无条带或条带弱。 | 叶片中多糖多酚含量较高，裂解混合液呈棕黄色甚至棕红色。 | 本试剂盒不适合多分多糖含量较高的样品。 |
裂解液、中和液加入比例不当，裂解混合液影响PCR体系的pH值。 | 正常条件下，中和后的裂解混合液的 pH 应该在7-8左右(裂解产物和Buffer P2严格按照1:1的量进行中和)。 | |
样本裂解混合液保存不当或保存时间过久，DNA基因组已经降解。 | 裂解混合液液可在4℃保存5天，尽量使用新制备的裂解液混合液进行PCR。 | |
模板加入量不适合。 | 在反应体系5-20%范围内优化模板加入量。 | |
PCR循环数不足。 | 适当增加PCR的循环数，推荐35-40循环为佳。因模板复杂，一般PCR反应要比用纯化的DNA模板多5-10个循环为佳。 | |
非特异性扩增 | PCR退火温度太低，循环数、引物浓度或模板浓度太高。 | 增加PCR退火温度，降低PCR循环数、引物浓度或模板浓度。 |
PCR引物错配。 | 重新设计PCR引物。 | |
配制PCR反应体系时温度太高或配制完成后放置时间太久。 | PCR反应体系的配制在低温下进行，配制完成后尽快进行PCR扩增反应。 | |
阴性对照出现目的条带 | 操作工具或试剂污染。 | 实验所有试剂或器材均应高压灭菌。操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。 |
样本间交叉污染。 | 每个取样器只对一个样本使用；或取完一个样本后，将取样器刃口浸入2%的次氯酸钠溶液中，反复涮洗，然后用干净的纸巾擦干残液。 |
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