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产品简介
| 供货周期 | 现货 | 规格 | 50T |
|---|---|---|---|
| 货号 | 10181ES50 | 应用领域 | 生物产业 |
产品介绍
Mouse Tissue Direct PCR Kit
小鼠组织直接PCR试剂盒
产品信息
产品名称 | 产品编号 | 规格 | 价格（元） |
Mouse Tissue Direct PCR Kit 小鼠组织直接PCR试剂盒 | 10181ES50 | 50 T | 326.00 |
Mouse Tissue Direct PCR Kit 小鼠组织直接PCR试剂盒 | 10181ES70 | 200 T | 755.00 |
产品描述
小鼠组织直接PCR试剂盒是一款可快速对小鼠鼠尾、鼠耳、肌肉等组织样本进行PCR扩增的试剂盒。本试剂盒采用*的裂解缓冲液体系，可以快速的裂解样品并释放出基因组DNA，不需要除去蛋白、RNA等，即可将释放出的基因组DNA作为模板直接用于PCR反应。此外，样品使用量少，低至5 mg小鼠组织或2-5 mm鼠尾即可进行实验。
本试剂盒中提供的2× Mouse Master Mix具有很强的扩增兼容性，能直接以待测样品裂解液为模板，进行高效特异性扩增。该试剂为2倍浓缩PCR反应混合液，包含了用于PCR扩增除模板和引物外的所有组分，大大简化操作过程，降低污染几率。
该试剂盒可用于转基因型鉴定、动物基因分型等。
产品组分
类别 | 编号 | 组分 | 产品编号/规格 | 储存 | |
10181ES50（50 T） | 10181ES70（200 T） | ||||
Part I | 10181-A | Buffer MP | 5 mL | 20 mL | 室温或4℃ |
10181-B | Protease Plus | 220 μL | 880 μL | 4℃ | |
10181-C | 6× DNA Loading Buffera | 1.5 mL | 1.5 mL | 4℃或-20℃ | |
Part II | 10181-D | 2× Mouse Master Mixb | 500 μL | 1 mL×2 | -20℃ |
a）6× DNA Loading buffer：不含SDS。
b）2× Mouse Master Mix：包含Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、MgCl2、反应缓冲液、PCR反应增强剂、优化剂以及稳定剂等。
运输方法
冰袋运输。
保存方法
1. 试剂10181-A【Buffer MP】，在常温干燥条件下，可保存12个月，如需保存更长时间可置于4℃。低温保存，易出现沉淀，可平衡至室温或37℃水浴10 min，待沉淀溶解后，混匀使用。
2. 试剂10181-B【Protease Plus】，具有*配方，为保证其更好的活性和稳定性，建议4℃保存，切勿置于-20℃。
3. 试剂10181-C【6×DNA Loading Buffer】，可置于4℃或-20℃长期保存。
4. 试剂10181-D【2× Mouse Master Mix】，-20℃保存，避免反复冻融。
操作方法
样品基因组DNA释放
1. 在离心管中加入100 μL Buffer MP，4 μL Protease Plus，轻轻涡旋混匀。
【注】：Buffer MP与Protease Plus混合后尽快使用，不宜长期保存。
2. 取5-10 mg动物组织或2-5 mm鼠尾，置于上述离心管中，轻轻涡旋混匀。
【注】：组织应尽量剪碎，以便酶解反应更顺利进行。
3. 65℃孵育10-30 min，然后95℃处理5 min。
【注】：65℃孵育，一般10 min即可满足多数PCR需求。若需要的DNA量较大或样品较难酶解，可将时间延长至30 min。组织块不需*酶解，残余的部分在后续离心步骤中可被除去。
4. 12000 rpm离心5 min。
5. 将上清转移至新的离心管，4℃或-20℃保存或直接用于PCR扩增。
PCR反应鉴定——PCR反应体系
组分 | 体积（μL） | 体积（μL） | 终浓度 |
ddH2O | To 20 | To 50 | - |
2× Mouse Master Mix | 10 | 25 | 1× |
Forward Primer (10 μM) | 0.5 | 1 | 0.2-0.25 μM |
Reverse Primer (10 μM) | 0.5 | 1 | 0.2-0.25 μM |
裂解产物（DNA模板） | X | X | - |
【注】：各组分使用前应充分混匀。
a）模板使用量：建议1-10%总体系，可设置梯度摸索*上样量。模版量过多时，抑制物会显著影响扩增效果。
b）引物终浓度：0.2-0.25 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可在0.1-0.5 μM范围内调整引物浓度。
c）反应体系：推荐使用20 μL或50 μL，以保证目的基因扩增的有效性和重复性。
d）体系配制：配制好PCR反应体系，置于涡旋仪上涡旋混匀，瞬时离心将反应液集于管底。
PCR反应鉴定——PCR反应条件
循环步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
预变性 | 94℃ | 3 min | 1 |
变性 | 94℃ | 10 sec | 30-40 |
退火 | 50-65℃ | 20 sec | |
延伸 | 72℃ | 30 sec/kb | |
终延伸 | 72℃ | 5 min | 1 |
【注】：a）退火温度：请参考引物的理论Tm值，建议退火温度可设置高于引物理论值 2℃。
b）延伸时间：按30 sec/kb设定，如不足30 sec，设置30 sec即可。
c）扩增循环数：35个循环已可以扩增足量产物。太多的循环将会导致非特异性扩增增加。
对照反应
在PCR结果分析时，不管是阳性结果或阴性结果，如果没有对照反应，都不能确定结果是否可靠。为了便于后续实验结果的分析，建议在进行PCR时，设置阳性和阴性PCR对照反应以便于排除假阳性或假阴性的干扰。
注意事项
1. 为了避免样本间交叉污染，每次取样后都需要将取样器材的刃口或与样本直接接触的部位浸入2%次氯酸钠溶液中，反复洗刷数次进行清洗，然后用干净的纸巾擦干残余液体后再进行使用。为了试验方便，也可准备多个取样器材，在使用完后进行统一清洗，确保每一单独样本均使用的是无污染的取样器材。
2. 建议使用新鲜采取的动物组织，若为长期冷冻组织，应尽量避免反复冻融，否则会导致模板的降解，影响PCR效率。
3. 试剂Buffer MP若低温保存，易产生沉淀。在使用前务必将其在室温中放置一段时间，也可在37℃水浴中预热10 min，以溶解沉淀，混匀后再使用。
4. 建议扩增片段长度1 kb以内，以便扩增效率*。
5. 电泳检测时，切勿使用含有SDS的Loading Buffer。否则，电泳时会在泳道中出现一大团拖尾亮带，影响实验结果。
6. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
常见问题与解决方法
常见问题 | 可能原因 | 解决方法 |
阳性对照、待测样本均无条带。 | PCR反应体系或反应条件不合适。 | 使用梯度PCR摸索PCR*反应条件。 |
PCR试剂保存不当失去活性。 | 2× PCR Mix应保存于-20℃，使用时避免反复冻融。若使用频繁，可在4℃短时间存放。 | |
引物设计问题。 | 尝试重新设计引物进行检查。 | |
阳性对照有目的条带，待测样本无条带或条带弱。 | 不当储存或长期储存引起试剂活性丧失。 | 使用新鲜的试剂。 |
加入组织裂解液过量。 | 增大反应体系，或减少裂解液的用量。 | |
样本裂解混合液保存不当或保存时间过久，DNA基因组已经降解。 | 裂解混合液液可在4℃保存2-3天，尽量使用新制备的裂解液混合液进行PCR。 | |
模板加入量不适合。 | 在反应体系10-20%范围内优化模板加入量。反应效性能较差时，可以降模板浓度调节到低于10%的范围。 | |
PCR循环数不足。 | 增加PCR的循环数，推荐在35-40循环为佳。因为模板复杂，PCR反应要比用纯化的DNA模板多5-10个循环为佳。 | |
非特异性扩增 | PCR退火温度太低，循环数、引物浓度或模板浓度太高。 | 增加PCR退火温度，降低PCR循环数、引物浓度或模板浓度。 |
PCR引物错配。 | 重新设计PCR引物。 | |
配制PCR反应体系时温度太高或配制完成后放置时间太久。 | PCR反应体系的配制在低温下进行，配制完成后尽快进行PCR扩增反应。 | |
阴性对照出现目的条带 | 操作工具或试剂污染。 | 实验所有试剂或器材均应高压灭菌。操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。 |
样本间交叉污染。 | 每个取样器只对一个样本使用；或取完一个样本后，将取样器刃口浸入2%的次氯酸钠溶液中，反复涮洗，然后用干净的纸巾擦干残液。 |
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