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翌圣生物科技（上海）股份有限公司
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产品简介
| 供货周期 | 现货 | 货号 | 12202ES08 |
|---|---|---|---|
| 应用领域 | 生物产业,制药/生物制药 |
产品介绍
Hieff NGS® Ultima Pro PCR Free DNA Library Prep Kit 全能型DNA建库试剂盒(PCR-Free)
产品描述
Hieff NGS® Ultima Pro PCR Free DNA Library Prep Kit全能型DNA建库试剂盒(PCR-Free)是针对Illumina®高通量测序平台专业开发设计的新一代PCR Free版建库试剂盒。本产品采用高质量的酶学组成，在前一代建库试剂盒的基础上，改进了DNA片段末端修复和加A效率，同时改善接头连接效率?？捎τ糜诔９娑参锘蜃?、微生物基因组、FFPE、cfDNA、ChIP DNA等样本，助力获得优异的测序数据。
1.适用500 pg-500 ng所有DNA样本，包含cfDNA、FFPE等
2.文库转化率，最高可达70%以上
3.多样本验证可获得优异的文库与测序数据
4.严格的批次性能与稳定性质控
产品组分
运输与保存方法
干冰运输。所有组分-20 °C保存，有效期1年。
注意事项
一、关于操作
1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀，短暂离心后置于冰上待用。
3. 配制各步骤反应液时推荐使用移液器吹打混匀或轻轻振荡，剧烈振荡可能会造成文库产出下降。
4. 为避免样品交叉污染，推荐使用带滤芯的枪头，吸取不同样品时请更换枪头。
5. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应，使用前应预热PCR仪至反应温度附近。
6. PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染，进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离；使用专用的移液器等设备；并定时对各实验区域进行清洁（使用0.5%次氯酸钠或10%漂白剂进行擦拭清理），以保证实验环境的洁净度。
7. 本产品仅作科研用途！
二、关于DNA片段化
1. 本试剂盒中兼容机械法及酶切法片段化的DNA。
2. 本试剂盒兼容范围为500 pg - 500 ng Input DNA。应尽可能使用A260/A280 = 1.8-2.0的高质量Input DNA。表1中列举了将本试剂盒应用于常见应用中推荐的Input DNA量。
表1.常见应用中推荐Input DNA量
应用 | 样本类型 | 推荐Input DNA量 |
全基因组测序 | 复杂基因组 | 50 ng-500 ng |
靶向捕获测序 | 复杂基因组 | 10 ng-500 ng |
全基因组测序，靶向捕获测序 | FFPE DNA | 50 ng-500 ng |
全基因组测序，靶向捕获测序 | cfDNA/ctDNA | ≥500 pg |
全基因组测序 | 微生物基因组 | ≥1 ng |
全基因组测序PCR-free测序 | 高质量DNA | ≥50 ng |
【注】：上表为使用高质量DNA时推荐的Input DNA量，当Input DNA质量较差或需要进行片段分选时，应适当上调使用量。
3. Input DNA特指投入末端修复/dA尾添加步骤中的DNA。
4. Input DNA制备过程中带入的高浓度金属离子螯合剂或其他盐，可能会影响末端修复/dA尾添加步骤反应效率，建议DNA片段化后进行磁珠纯化或分选。当使用机械法进行DNA片段化且产物不进行纯化或长度分选而直接建库时，请将DNA稀释在TE Buffer中进行片段化，请勿在灭菌超纯水中进行。当使用酶切法进行片段化且产物不进行纯化或长度分选而直接建库时，请确认Stop Buffer中不包含过量的金属离子螯合剂。如条件不满足，可先将片段化产物纯化或长度分选后溶于TE buffer或灭菌超纯水中（≤50 μL)，再进行文库构建。
三、关于接头连接（Adapter Ligation)
1. 针对Illumina®测序平台，Yeasen提供48种Barcoded Adapters: Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 1~Set 4 (Cat#12615~Cat#12618)；单端 96种 Index Primers: Hieff NGS® 96 Single Index Primers Kit for Illumina®, Set 1~Set 2 (Cat#12611~Cat#12612)；双端384 种UDI Primers: Hieff NGS® Stubby UDI Primer Kit for Illumina® (Cat#12404~Cat#12407)。
2. Adapter的质量和使用浓度直接影响连接效率及文库产量。Adapter用量过高可能会产生较多Adapter Dimer；用量较低可能会影响连接效率及文库产量。表2列举了使用本试剂盒，不同Input DNA量推荐的Adapter使用量。
表2.500 pg-1 μg Input DNA推荐的Adapter使用浓度
Input DNA | Adapter : Input DNA摩尔比 | Input DNA | Adapter : Input DNA摩尔比 |
1 μg | 10:1 | 50 ng | 100:1 |
500 ng | 20:1 | 25 ng | 200:1 |
250 ng | 40:1 | 1 ng | 200:1 |
100 ng | 100:1 | 500 pg | 400:1 |
【注】：Input DNA摩尔数 (pmol)≈ Input DNA质量(ng)/ [0.66 × Input DNA平均长度 (bp)]。
四、关于磁珠纯化与分选 (Bead-based Clean Up and Size Selection)
1. DNA片段长度分选步骤可选择在末端修复/dA尾添加之前，或接头连接后，或文库扩增后进行。
2. 当Input DNA质量≥50 ng，您可选择在接头连接后分?。蝗鏘nput DNA质量<50 ng，建议您在文库扩增后进行分选。
3. Ligation Enhancer中包含高浓度的PEG，会对双轮磁珠分选产生显著影响。因此，如在接头连接后进行长度分选，必须先进行纯化步骤，再进行双轮分选步骤！；如在末端修复/dA尾添加之前或文库扩增后进行长度分选，可直接进行双轮磁珠分选步骤。
4. 磁珠使用前应先平衡至室温，否则会导致得率下降、分选效果不佳。
5. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。
6. 转移上清时，请勿吸取磁珠，即使微量残留都将影响后续文库质量。
7. 磁珠漂洗使用的80%乙醇应现用现配，否则将影响回收效率。
8. 进行长度分选时，初始样品体积应尽量≥100 μL，不足时请用超纯水补齐。以防因样品体积太小导致移液误差增大。
9. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应；过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下，室温干燥3-5 min足以让磁珠充分干燥。
10. DNA纯化或长度分选产物如需保存，可使用TE Buffer洗脱，产物可于4 °C可保存1-2周，-20 °C可保存1个月。
五、关于文库质检 (Library Quality Analysis)
1. 通常情况下，构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。
2. 文库浓度检测可使用：基于双链DNA荧光染料的方法，如Qubit®、PicoGreen®等；基于qPCR绝对定量的方法。
3. 文库浓度检测不可使用：基于光谱检测的方法，如NanoDrop®等。
4. 推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测：Qubit®、PicoGreen®等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法时，无法有效区分单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物以及其他不完整双链结构产物；qPCR绝对定量基于PCR扩增原理，仅定量样品中两端Adapter完整的文库（即可测序的文库），可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库的干扰。
5. 文库长度分布检测，可通过Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。
