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翌圣生物科技（上海）股份有限公司
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行业痛点
随着诊断试剂盒开发人员不断要求降低检测所需的样本量，对 PCR/mNGS/tNGS等主流检测方法的要求越来越高，需要更高的灵敏度来检测目标核酸。当只有少数目标分子可用时，市售的常规Taq DNA聚合酶里面含有的DNA基因组残留导致的DNA污染的问题会加剧，微量的污染DNA可能会产生非特异性扩增，使得扩增效率降低，影响阳性判断值的确定，降低检测试剂开发的灵敏度，给开发者带来极大的阻碍和挑战。
此外，当检测靶标与扩增体系里残留的宿主DNA和外源核酸相关时，往往出现NTC和阴性样本起峰的现象，影响最终结果判读。
如图1，样本B的扩增Ct值与NTC的越接近，结果就越不确定；好的结果需要NTC和样本曲线之间有良好的分离。
如果样本中的目标物浓度越来越低，改进检测?法的有效途径是将NTC曲线进?步向右移动（更大的Ct值）。使?洁净的分子酶原料通?；峤玁TC曲线向右移动，从?获得更好的结果：
---来?相同样本的检测可靠性（即样本与阴性对照的更好分离）；
---在相同确定性下检测的下限进一步提高（即样本与?模板对照仍能分离，检测到更低?平的?标）。
图1. 样本A比样本B浓度更高，但大多数样本的?标物或模板物浓度较低，更类似于样本B，NTC越靠后，检测灵敏度和可靠性更高
解决方案
为达到早筛早诊的目的，样本浓度越来越低，宿主核酸和背景菌的干扰，容易导致漏检或不确定结果，降低诊断试剂盒检测的灵敏度和可靠性。
为了解决病原检测中背景菌及宿主核酸残留带来的干扰问题，为临床分子诊断试剂盒开发 、科研机构等提供更洁净、更高性能的分子酶原料，翌圣生物开发了的超低残留去除技术，建立了遵循GMP标准的超洁净分子酶生产基地-UCF.ME，以及严格按照ISO13485质量管理体系进行各环节把关，严控人（人员）、机（机器）、料（试剂、耗材）、法（工艺）、环（环境）、测（标准），有效的技术手段、洁净的生产环境和严格的质量控制结合，既控制外源性污染，又做好内源性杂质去除，从而实现超净分子酶的开发目标。这些分子酶原料的洁净度相较常规商业产品高出几个数量，是要求高灵敏度和可靠性的应用中的理想选择 。
图2. 翌圣超低残留分子酶质量监控流程图
超低残留去除技术
常规分子酶生产工艺需要的纯化步骤多，且产量较低。制备低残留高纯度的分子酶产品时，产量与纯度之间难以平衡，且可控性差，合格率低，因而导致批次间差异较大。翌圣生物开发的超低残留去除技术纯化步骤由繁变简，有针对性的去除相关残留，在精准高效地去除残留的同时，提高纯化工艺的稳定性与产量，降低批间差。
图3. 翌圣超低残留去除技术示意图
GMP标准的UCF.ME®超洁净分子酶生产基地
UCF.ME：Ultra Clean Factory . Molecular Enzyme，即超洁净分子酶生产制造。
封闭系统：全封闭的生产系统，无菌的罐子和管路，以及支持全生产线在线清洁的全自动CIP/SIP系统，降低了DNA污染的可能。
环境控制：在符合D级、C级和局部洁净室标准的环境中生产，防止接触DNA污染物，保证了酶的洁净度。
硬件保障：按照工艺需求进行深度定制的全进口生产设备，支持关键参数全程在线监控和反馈调整，确?？刂撇问木级?，同时还保证数据的可追溯性。
水质控制：按现行2020版中国药典标准严格执行，从源头上保证生产用水的无菌性。
规模效应：吨级以上量产，确保了产品的均一性、稳定性和供货的及时性，有利于成本控制。
ISO13485质量管理体系
翌圣生物是家以分子酶产品通过ISO 13485:2016质量体系认证的企业，从原料采购、生产管理、质量控制、仓储运输等各个环节都严格在质量体系的监管下开展，生产、检验过程实施动态监控，对现场发现人的着装、设备的状态、物料的进出、方法的确认、环境的维护、测量的运行等方面的问题，分析产生的具体原因，协助责任部门共同完成整改，以保证生产、检验操作，按照标准SOP进行，有据可依，有章可循，为持续输出质量稳定的、满足法规和顾客需求的产品，提供质量保证。
图4. 翌圣ISO13485认证超洁净分子酶生产基地
同时，使用翌圣生物自研的高灵敏度E.coli 宿主细胞 DNA 残留检测试剂盒在不同阶段精心追踪分子酶样品，最大限度降低最终分子酶产品核酸污染的风险。
平台产出
鉴于目前分子诊断试剂盒开发企业对于DNA/RNA全预混荧光定量PCR原料的迫切需求，诸多研究人员都在研究过程中发现使用低残留的分子酶原料，开发全预混体系的成功率更高。
此外，在常规酶原料和低残留酶原料的筛选、测试过程中，研发人员发现低残留原料对于部分体系的检测性能有提高，如Ct值提前等。
翌圣生物推出了全套低残留酶原料，包括 Taq DNA 聚合酶、逆转录酶、UDG 酶、RNase 抑制剂及适配 buffer 组分，旨在满足科研和工业用户开发更洁净、高性能分子诊断试剂盒的需求。适用于以下应用体系的开发：
低残留体系开发：开发体系检测靶标与常见宿主E.Coli及环境背景菌基因组DNA序列一致或者比较相似，可选择该套低残留酶原料进行体系开发，这套酶原料对DNA污染控制在极低水平（如Taq DNA聚合酶E. coli基因组DNA残留＜0.02copy/100U）。
高灵敏度体系开发：在进行高灵敏度体系的开发，或对现有产品进行迭代以提升试剂盒检测灵敏度的项目中，也可选择这套低残留酶原料。更纯净的酶原料能降低体系中序列的复杂度，提高引物与目标模板结合的扩增效率，从而提升低浓度模板的检出率，同时增大与无模板对照（NTC）的分离程度，有助于确定试剂盒更高的检测灵敏度。
全预混体系开发：针对全预混体系开发，这套低残留酶原料选用 20 多套不同来源的引物探针，进行了 37℃ 7 天全预混稳定性的质量控制，确保其在全预混体系开发方面具有通用性。此外，该原料采用单组分的产品形式，为试剂盒开发者在体系调试时提供了更高的灵活度，更有利于开发适配性更佳、性能更优的 qPCR/RT-qPCR 全预混体系。
部分性能展示：
E. coli基因组DNA残留＜0.02 copies/ 100 U，保持行业水平
qPCR体系全预混性能：37℃加速7天，稳定性高
图6. 分别使用低残留和常规的Taq DNA聚合酶、UDG酶，搭配相同的反应buffer，和HPV、内标引探与所有试剂组分提前预混，在37℃条件下放置7天，与-20℃正常保存的试剂，同时检测浓度为10 拷贝/微升的模板，结果显示，常规单酶在热加速处理后荧光值会出现不同程度的降低，而低残留单酶在37℃加速7天后，与-20℃正常保存的试剂相比，扩增曲线峰形、荧光值、Ct值都没有变化，稳定性更高。
RT-qPCR体系全预混性能：37℃加速5天，稳定性高
图7. 使用低残留逆转录酶、Taq酶、UDG酶和RNase抑制剂，配置成RT-qPCR体系，将各类靶标引探与所有试剂组分提前预混，在37℃条件下放置5天，与-20℃正常保存的试剂同时扩增Ct值35左右的模板核酸，结果显示，该体系在37℃加速5天后，与-20℃正常保存的试剂相比，扩增曲线峰形、荧光值、Ct值基本没有变化，检出率一致，RNA全预混体系稳定性高。
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逆转录酶 | Hifair UCF. ME® Advanced Reverse Transcriptase (200 U/μL) | 14614ES |
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RNase抑制剂 | UCF.ME® Advanced Murine RNase Inhibitor (40 U/µL) | 14676ES |
反应Buffer | 5×E-Taq DNA Polymerase PCR Buffer | 16715ES |
5×Taq DNA Polymerase PCR Buffer | 16716ES | |
2×TaqMan Multiplex RT-qPCR Buffer | 16718ES |
