一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備?

1. ?樣本來(lái)源?

• ?人類(lèi)樣本?：關(guān)節(jié)置換術(shù)獲取的滑膜組織（RA、骨關(guān)節(jié)炎或創(chuàng)傷患者）
  

• ?小鼠樣本?：C57BL/6小鼠髖關(guān)節(jié)周?chē)そM織
  

2. ?試劑與耗材?

• 消化酶：0.5% IV型膠原酶（人類(lèi)）或Pancreatin?（小鼠）
  

• 培養(yǎng)基：DMEM/F12 + 10% FBS + 1%雙抗
  

• 器械：眼科剪、鑷子、200目細(xì)胞篩、15ml離心管
  

?二、組織處理與消化?

1. ?組織清洗?

• 人類(lèi)樣本：PBS沖洗去除血液，剔除脂肪及壞死組織
  

• 小鼠樣本：75%乙醇浸泡5分鐘后剝離滑膜
  

2. ?消化方法?

• 剪碎組織后加入0.5% IV型膠原酶，37℃振蕩消化60分鐘（人類(lèi)）
  

• 小鼠滑膜需額外渦輪振蕩1.5分鐘以提高細(xì)胞釋放率
  

• ?酶消化法?：

• ?組織塊法?：將1mm3組織塊直接貼壁培養(yǎng)，48小時(shí)后補(bǔ)充培養(yǎng)基

?三、細(xì)胞培養(yǎng)與純化?

1. ?初次培養(yǎng)?

• 消化產(chǎn)物經(jīng)100μm濾網(wǎng)過(guò)濾，離心（1000rpm, 5分鐘）后重懸接種

• 培養(yǎng)條件：37℃、5% CO?，換液時(shí)間為接種后3小時(shí)（去除未貼壁細(xì)胞）

2. ?差速貼壁純化?

• 傳代時(shí)采用Pancreatin?短時(shí)消化（30秒-1分鐘），優(yōu)先收集成纖維細(xì)胞（巨噬細(xì)胞殘留較少）

• 通過(guò)3次傳代（15-20天）可去除99%的滑膜巨噬細(xì)胞

?四、鑒定與質(zhì)量控制?

1. ?形態(tài)學(xué)鑒定?

• 原代SFs呈梭形，核橢圓形，貼壁生長(zhǎng)

• 混雜的圓形巨噬細(xì)胞隨傳代逐漸消失

2. ?免疫標(biāo)記?

• Vimentin陽(yáng)性（＞98%）、CD68陰性（流式或免疫熒光）

?五、注意事項(xiàng)?

• ?污染控制?：滑膜組織含血管豐富，需加強(qiáng)雙抗處理

• ?消化優(yōu)化?：膠原酶濃度過(guò)高（＞1%）可能導(dǎo)致細(xì)胞活性下降

• ?培養(yǎng)基選擇?：含20% FBS可促進(jìn)初期貼壁，但需逐步降至10%以避免過(guò)度增殖

?六、應(yīng)用方向?

• ?RA研究?：通過(guò)SFs侵襲實(shí)驗(yàn)?zāi)M滑膜炎病理過(guò)程
  

• ?藥物篩選?：測(cè)試抗纖維化或抗炎藥物對(duì)SFs活性的影響