實(shí)驗(yàn)原理

MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽)是一種黃色水溶性化合物，可被活細(xì)胞線(xiàn)粒體中的琥珀酸脫氫酶還原為藍(lán)紫色不溶性甲臜(Formazan)結(jié)晶2。甲臜結(jié)晶量與活細(xì)胞數(shù)量成正比，通過(guò)DMSO溶解后可用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值，間接反映細(xì)胞增殖狀態(tài)。

實(shí)驗(yàn)材料

• ?細(xì)胞樣本?：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞(推薦70-80%融合度)
  

• ?主要試劑?：

• MTT溶液(5mg/mL，PBS配制)
  

• DMSO(分析純)
  

• 培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)
  

• ?儀器設(shè)備?：

• 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板
  

• CO?培養(yǎng)箱
  

• 酶標(biāo)儀(檢測(cè)波長(zhǎng)490nm)
  

實(shí)驗(yàn)步驟

細(xì)胞接種

1. 消化收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)
   

2. 96孔板每孔接種100μL細(xì)胞懸液(密度1×103-1×10?個(gè)/孔)
   

3. 邊緣孔用無(wú)菌PBS填充減少蒸發(fā)干擾
   

藥物處理

1. 細(xì)胞貼壁后(通常24小時(shí))，加入不同濃度待測(cè)藥物
   

2. 每個(gè)濃度設(shè)3-5個(gè)復(fù)孔
   

3. 37℃、5% CO?繼續(xù)培養(yǎng)12-48小時(shí)
   

MTT染色

1. 每孔加入10μL MTT溶液(終濃度0.5mg/mL)
   

2. 繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)
   

3. 小心吸棄上清(懸浮細(xì)胞需先離心)
   

甲臜溶解

1. 每孔加入100-150μL DMSO
   

2. 低速振蕩10分鐘使結(jié)晶充分溶解
   

檢測(cè)分析

1. 酶標(biāo)儀490nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔OD值
   

2. 計(jì)算抑制率：[(對(duì)照組OD-實(shí)驗(yàn)組OD)/對(duì)照組OD]×100%
   

關(guān)鍵參數(shù)優(yōu)化

• ?細(xì)胞接種數(shù)?：根據(jù)增殖速度調(diào)整(快速增殖細(xì)胞可減少至1×103個(gè)/孔)
  

• ?MTT反應(yīng)時(shí)間?：2-4小時(shí)(時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易產(chǎn)生毒性)

• ?檢測(cè)范圍?：OD值控制在0-0.7之間保證線(xiàn)性關(guān)系

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