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前言

抗体-小分子药物偶联物（antibody drug conjugates, ADCs）, 是治疗性生物制品的一类，可通过抗体精准识别靶向细胞，通过内吞作用进入靶向细胞后释放出偶联的小分子药物，从而实现对靶向细胞精准杀灭的目的，并减少对于正常细胞的杀伤。由于ADC的设计原理，自2000年第一个ADC 药物Mylotarg® (gemtuzumab ozogamicin) 被 FDA 批准后[1], 截止2025年6月，已经有19个ADC被批准上市。自2023年全球ADC销售总额第一次突破百亿美元后，2024年全球ADC销售总额继续超过百亿美元，持续了强劲的增长势头。 

该药物于2013年被FDA批准上市，用于HER2阳性乳腺癌的治疗，2024年全球销售额约为23亿美元[2]。恩美曲妥珠单抗是一种靶向 HER2 的ADC，含有人源化抗-HER2 IgG1 曲妥珠单抗，该抗体通过稳定的硫醚连接体 MCC（4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯）与微管抑制药物 DM1（美坦辛衍生物）共价结合，分子量分布范围在147~158kDa, 其药物/单抗偶联比（drug to antibody ratio, DAR）分布为0~8，平均DAR约为3.5 [3]。由于其结构的复杂性，对其进行表征就显得颇具挑战性。在本文的研究中，我们使用今年美国质谱年会（ASMS）上刚刚发布的新一代二合一超高分辨质谱仪Excedion Pro Biopharma 对KADCYLA进行了全面的表征，证明了该平台在生物制药领域中出色的分析能力，尤其是电子转移解离辅助高能碰撞碎裂（electron-transfer/higher-energy collision dissociation， EThcD）功能，有助于精准鉴定药物偶联位点，以及翻译后修饰（Post-translational modification, PTM）的鉴定。

应用亮点

如前文所述，今年新发布的新一代二合一超高分辨质谱仪Excedion Pro Biopharma被用于KADCYLA的深入表征。该仪器的亮点包括但不仅限于拓展至m/z=12,000 Da的质量检测范围 （需配置BioPharma option），能够满足在非变性条件下对单克隆抗体单体/二聚体/三聚体，以及其他大分子量蛋白复合物进行分子量测定；选配的ETD功能，可以实现快速灵敏的ETD/EThcD碎裂，与高能碰撞碎裂（Higher-energy Collisional Dissociation, HCD）联合使用，能够获得全面丰富的蛋白序列覆盖度以及PTM鉴定信息。Excedion Pro Biopharma仪器结构如图1所示，图2展示了本次实验中KADCYLA深入表征的流程。 

图1. Excedion Pro BioPharma结构图，相较于前代产品的硬件更新部分在图上以蓝色高亮标明。选配BioPharma Edition可以将质量检测范围拓展至m/z=12,000 Da (绿色方框部分)，选配ETD可以实现ETD/EThcD碎裂（红色方框部分）。（点击查看大图）

图2. KADCYLA表征流程图。

（点击查看大图）

非变性条件下KADCYLA完整分子量测定

完整分子量测定是生物医药类产品表征中的一项，对于ADC而言，除完整分子量外，平均DAR值和药物负载分布 （drug load distribution, DLD）也是评判药物质量的关键属性。在本实验中，我们在非变性条件下对KADCYLA进行完整分子量测定。非变性条件使用中性缓冲盐体系，与变性条件相比，蛋白分子更接近其天然状态，且非变性条件下蛋白带电更少，相邻电荷态之间的质谱峰重叠更少，能够减少质谱信号之间的互相干扰，有助于得到更准确的完整分子量测定结果。图3展示了KADCYLA非变性条件下完整分子量测定的结果。为了使样品更接近天然状态，我们并未对其进行脱糖处理。由图3A可见，在原始谱图层面，偶联了不同数目药物和不同糖型组分的质谱峰基本实现基线分离，经解卷积后可清晰的观察到0~8的药物偶联分布（图3B），BioPharma Finder软件可自动计算平均DAR值，该ADC的平均DAR值为3.47 （图3C），与文献报道的3.5一致。

（A）

（B）

（C）

图3. 非变性条件下KADCYLA完整分子量测定结果。 A, 原始谱图及局部放大图。B, 解卷积谱图。C，BioPharma Finder软件能够自动选取相关组分并计算平均DAR值。（点击查看大图）

数据依赖性的EThcD二级碎裂用于肽图分析，

实现偶联位点定位以及PTM鉴定

基于液质联用的肽图分析是生物治疗型产品表征中的常用分析方法之一，可实现序列覆盖度、各种化学修饰位点定位以及常见翻译后修饰的定性定量分析等。在各种质谱碎裂技术中，由于HCD碎裂能够将肽键打断后产生丰富的b/y碎片离子用于肽段鉴定，故其被广泛应用于肽图分析中。然而，对于一些修饰肽段，例如糖肽、连接子-药物偶联肽段等，由于HCD会将糖链/连接子-药物偶联打碎，所以对于有多个潜在修饰位点的肽段，使用HCD碎裂无法精确定位修饰位点；另外，对于一些含有异构化氨基酸的肽段，例如亮氨酸/异亮氨酸、天冬氨酸/天冬氨酸异构化等，由于HCD产生的b/y离子质量相同，故无法对其进行区分。而ETD因为反应机理不同，既可以在碎裂肽段骨架的同时完整保留糖链、连接子-药物偶联等侧链修饰，对于异构化氨基酸，也可以产生特征性的诊断离子，从而实现异构化氨基酸的鉴定和区分。在ETD碎裂的基础上添加HCD辅助碎裂，即EThcD，可以在同一张二级谱图中同时得到b/y及c/z离子，得到更加全面丰富的信息实现肽段，尤其是修饰/异构化肽段的表征。Excedion Pro 二合一超高分辨质谱仪配备ETD选项后，可实现快速、灵敏的ETD/ETchD碎裂，可以设置数据依赖性的EThcD二级碎裂（data dependent EThcD MS2, dd EThcD MS2）数据采集模式，与数据依赖性的HCD二级碎裂（dd HCD MS2）形成互补，以获得肽图分析信息。

在本文的研究中，我们分别使用Trypsin和AspN两种蛋白酶对KADCYLA进行了变性酶解，随后对于两种不同蛋白酶酶解的样品，均进行了dd HCD MS2 以及 dd EThcD MS2数据采集，以获得序列覆盖度、偶联位点分布和翻译后修饰等信息。使用dd HCD MS2，Trypsin和AspN酶解的样品均可实现一针进样100%序列覆盖度（数据未展示）。图4展示了使用dd EThcD MS2, Trypsin和AspN酶解的样品肽图分析的基峰谱图（Base Peak Chromatogram, BPC）以及序列覆盖图，同样可以达到一针进样100%序列覆盖度，证明了Excedion Pro 二合一超高分辨质谱仪的ETD/ETchD碎裂可与常规流速液相色谱兼容，获得高质量的二级谱图用于肽图分析。 

图4. KADCYLA肽图分析基峰谱图和序列覆盖度，均为dd ETchD MS2数据采集模式。左，Trypsin酶解样品。右，AspN酶解样品。 对于不同蛋白酶酶解样品，均可实现单针进样100%序列覆盖。（点击查看大图）

如前文所述，KADCYLA的连接子-药物（MCC-DM1）是通过共价结合方式偶联在赖氨酸上的，曲妥珠单抗的N末端也会发生偶联，故对于整个KADCYLA分子而言，潜在的偶联位点共有92个，其中不重复的位点有46个（图5）。由于赖氨酸被共价偶联后会产生空间位阻，导致trypsin漏切，所以trypsin酶解会产生包含多个赖氨酸的连接子-药物偶联肽段，而HCD碎裂会同时打碎肽段骨架和偶联药物，导致无法仅凭HCD二级谱图准确判断药物偶联位点。而EThcD由于碎裂机理不同，可以在碎裂肽段骨架的同时保留药物偶联基团，优化后的HCD辅助碎裂能量可以使肽段碎裂更充分，同时保留完整偶联的药物。表1展示了分别使用HCD和EThcD对Trypsin酶解样品进行二级碎裂，获得的药物偶联位点信息汇总，46个潜在修饰位点中，鉴定到了43个存在药物修饰，可见使用EThcD碎裂，对于含有多个潜在偶联位点的肽段，可以准确定位偶联位置，与HCD结果结合，可以获得全面详实的偶联位点信息。

图5. KADCYLA分子全部潜在修饰位点，以红色方框在蛋白序列中标出，总共92个位点，其中不重复的有46个位点。

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表1. KADCYLA鉴定位点汇总

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红色字体，偶联位点。“++”, 偶联位点可通过二级碎片离子确认。 “+”, 该肽段上存在偶联，但无法通过碎片离子确认具体偶联位置?！?”, 未鉴定到偶联。

使用AspN对KADCYLA进行酶解时，重链会产生一条含有三个赖氨酸的肽段DK(216)K(217)VEPK(221)SC，且通过trypsin酶解样品的肽图分析结果可知，这三个赖氨酸均有被偶联的可能。KADCYLA的MCC-DM1连接子-药物含有一个异构中心（图6，左上），导致药物偶联肽段在反相色谱上均会以对峰的形式被洗脱。如图6所示，由于多个潜在偶联位点和MCC-DM1异构化中心的存在，肽段DK(216)K(217)VEPK(221)SC的提取离子流图（Extract ion current, XIC）呈现多组对峰。得益于EThcD碎裂产生的信息丰富的二级谱图，可以准确鉴定不同保留时间洗脱的肽段是哪一个位点发生了偶联（图6，下），并且可以根据XIC峰面积计算每种修饰的相对比例（图6，右上）。

图6. 通过EThcD对含有多个偶联位点的肽段进行偶联位点鉴定。（点击查看大图）

对于ADC样品，除药物偶联位点外，与药品质量相关的各种翻译后修饰也需要表征和监控。图7展示了基于EThcD二级碎裂谱图，对肽段FNWYVisoD(283)GVEVHNAK的天冬氨酸异构化的鉴定结果。得益于仪器平台的高灵敏度和高质量精度，即使相对含量只有未修饰肽段0.18%的异构化肽段，仍然可以鉴定到丰富的c/z离子，还有天冬氨酸异构化在ETD碎裂中产生的特征性c+57/z-57离子，从而实现天冬氨酸异构化的确证。对于其他常见的翻译后修饰，如脱酰胺、氧化和糖基化等，均可得到相对定量结果（图8）。

图7. 使用EThcD碎裂确认天冬氨酸异构化。下方局部放大图可观察到c+57/z-57离子。（点击查看大图）

图8. 其他常见翻译后修饰相对定量结果，所有结果均为三针dd ETchD MS2重复进样平均值。A, 甲硫氨酸氧化。B, 天冬酰胺脱酰胺。C, 天冬酰胺琥珀酰亚胺化。D, 色氨酸氧化。E, 重链N-糖基化。（点击查看大图）