蛋白磷酸化怎么檢測檢測技術(shù)服務(wù)詳情介紹

蛋白磷酸化（Protein Phosphorylation）是生物體內(nèi)zuì為常見也是研究zuì為廣泛的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾。其原理是在蛋白激酶的催化作用下，將一個ATP或GTP的γ位磷酸基轉(zhuǎn)移到底物蛋白質(zhì)的氨基酸殘基上，這一過程影響了人類細胞中超過1/3的蛋白質(zhì)的功能。

圖1 蛋白磷酸化示意圖

蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化這一可逆過程幾乎調(diào)節(jié)著包括細胞的增殖、發(fā)育、分化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞凋亡、神經(jīng)活動、肌肉收縮及腫瘤發(fā)生等過程在內(nèi)的所有生命活動。因此，對其進行檢測顯得尤為重要，常見的蛋白磷酸化修飾檢測方法有以下幾種：

1、32P 同位素放射性標記法

32P放射標記法是zuì經(jīng)典的磷酸化蛋白檢測方法，主要是通過純化激酶及［γ－32P］進行體外標記，或利用［γ－32P］－ATP或32PO43－（正磷酸鹽）平衡胞內(nèi)的ATP水平進行體內(nèi)標記，然后通過一維或二維凝膠電泳（1-或 2-DE）等分離技術(shù)對蛋白質(zhì)進行分離，zuì后用放射自顯影或磷儲屏檢測磷酸化蛋白。

2、蛋白免疫印跡法（Western Blot）

蛋白質(zhì)樣品通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后，在膠面上會形成按分子量大小排列的清晰條帶。隨后將這些蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF（聚偏氟乙烯膜）或NC膜（硝酸纖維素膜）上，與特異性磷酸化抗體結(jié)合，再用酶或同位素標記的二抗檢測，通過顯色或自顯影觀察磷酸化蛋白。

3、熒光染色法

Pro-Q Diamond 是一種專門標記磷酸化蛋白的熒光染料。通過熒光掃描儀檢測可以直接顯示出一維或二維凝膠電泳膠上分離的磷酸化蛋白，對非磷酸化蛋白的反應(yīng)性很低。熒光強度會隨著蛋白磷酸化程度的不同而呈現(xiàn)出一定的量的變化。該染料可以與其它檢測總蛋白的熒光染料配合使用，同時展示出膠上的總蛋白譜和磷酸蛋白譜。

4、流式細胞技術(shù)

流式細胞術(shù)采用熒光標記的單細胞懸液為檢測樣品，通過檢測標記熒光的熒光強度來確定所檢測細胞或細胞因子的濃度。應(yīng)用流式細胞技術(shù)檢測熒光標記的磷酸化蛋白特異性抗體可以jīngquè測量單細胞內(nèi)的多參數(shù)磷酸化，可以同時在不同的細胞亞群中分析幾種信號通路組成元件，大大提高了工作量。

5、質(zhì)譜法

質(zhì)譜法原理是將蛋白多肽離子化，因質(zhì)荷比不同，多肽在進入分析器時發(fā)生分離，通過測量分離肽段離子的相關(guān)參數(shù)，運用軟件實現(xiàn)蛋白鑒定及功能分析。磷酸化蛋白肽段常不穩(wěn)定，在質(zhì)譜中會由于自發(fā)亞穩(wěn)態(tài)分解或碰撞誘導(dǎo)裂解。利用磷酸酯酶處理后，磷酸化肽段易于丟失 H3PO4 或 HPO3，磷酸化sīānsuān或sūānsuān質(zhì)量數(shù)丟失98 u，而磷酸化làoānsuān由于磷酸基團連接在苯環(huán)上只丟失80 u。質(zhì)譜利用這些特征可以對磷酸化肽段進行鑒定。

6、Bio-Plex 懸液芯片

Bio-Plex 懸液芯片系統(tǒng)是美國伯樂公司開發(fā)提供的一個功能強大的芯片技術(shù)平臺，該技術(shù)整合了軟件包、系統(tǒng)校檢工具、微球體偶聯(lián)試劑和即用型細胞因子與磷酸化蛋白測試試劑盒，可在單個樣品中同時分析多種生物分子，包括酶底物、受體、抗原或者抗體。經(jīng)過懸液芯片多重檢測獲得的數(shù)據(jù)，更有助于從整體揭示生命分子間的相互關(guān)系及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

表1不同蛋白磷酸化檢測方法優(yōu)缺點對比

鑒定蛋白質(zhì)復(fù)合物樣品中相關(guān)蛋白磷酸化修飾是蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域中的一個重要部分，目前已經(jīng)有多種蛋白磷酸化分析方法，它們各有優(yōu)缺點，可以根據(jù)實驗需要進行選用。百泰派克生物科技使用Thermo公司zuì新推出的Obitrap Fusion Lumos質(zhì)譜儀結(jié)合Nano-LC，為廣大科研工作者提供蛋白質(zhì)磷酸化檢測一站式服務(wù)，只需要將您的需求告訴我們并寄送樣品，百泰派克生物科技負責項目所有后續(xù)，包括蛋白提取、蛋白酶切、磷酸化或糖基化肽段富集、肽段分離、質(zhì)譜分析、質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)分析、生物信息學(xué)分析所有事宜，并為您提供詳細的中英文雙語版技術(shù)報告，歡迎免費咨詢。

百泰派克生物科技--生物制品表征，多組學(xué)生物質(zhì)譜檢測優(yōu)質(zhì)服務(wù)商

北京百泰派克生物科技有限公司（Beijing Bio-Tech Pack Technology Company Ltd. 簡稱BTP）從事以生物質(zhì)譜為依托的生物藥物表征，大分子物質(zhì)（包括蛋白質(zhì)、多肽、代謝物）質(zhì)譜分析以及小分子物質(zhì)檢測服務(wù)。 1、公司采用ISO9001質(zhì)量控制體系，zhuānyè提供以質(zhì)譜為基礎(chǔ)的CRO檢測分析服務(wù)； 2、獲國家CNAS實驗室認可，為客戶提供符合全球藥政法規(guī)的藥物質(zhì)量研究服務(wù)； 3、業(yè)務(wù)范圍覆蓋蛋白質(zhì)組學(xué)、多肽組學(xué)、代謝組學(xué)、生物藥物表征、單細胞分析、單細胞質(zhì)譜流式、生信云分析以及多組學(xué)生物質(zhì)譜整合分析等； 4、7大質(zhì)量控制檢測平臺，滿足您一站式服務(wù)需求； 5、服務(wù)3000+企業(yè)，10000+客戶的選擇； 6、致力于為您提供優(yōu)質(zhì)的生物質(zhì)譜分析服務(wù)!

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