顶空气相色谱系列讲座（18）  

人体血液中一氧化碳的分析——分光光度法定量5

三、分光光度法

1、紫外光谱法原理

CO中毒血中可能含有三种血红蛋白： ⑴碳氧血红蛋白（HbCO）——与CO结合的Hb； ⑵ 氧合血红蛋白——与O2结合的Hb  ⑶血红蛋白——没结合的Hb。 它们在500nm~600nm范围内吸收光谱见图-2。碳氧血红蛋白zui大吸收峰分别在568.2nm和538nm；氧合血红蛋白zui大吸收峰分别在576.2nm和542nm；血红蛋白zui大吸收峰在555nm。如血液含三种形式的血红蛋白（其中的微量高铁血红蛋白可忽略不计），则其光谱呈现三种光谱的混合形。如在血液中加入还原剂（连二亚硫酸钠或硫化铵）溶液，则可将氧合血红蛋白及高铁血红蛋白还原为血红蛋白，而碳氧血红蛋白不被还原，因而血液中只存在碳氧血红蛋白和血红蛋白两种不同的形式，它们的吸收光谱见图-1





用分光光度法测定血中HbCO定性和定量是基于HbCO和对光谱的特征吸收不同，和特征吸收与浓度有量的关系。HbO2在589nm~577nm和556nm~536nm区间有两条吸收谱带，其zui大吸收是579nm和542nm。HbCO在579nm~564nm和548nm~530nm区间有两条吸收谱带，其中zui大吸收是572nm和539nm。加入还原剂后检血中HbO2和高铁血红蛋白被还原为血红蛋白（Hb），此时吸收谱带变为一条，即在530nm~580nm之间，zui大吸收为556nm。而HbCOzui大吸收波长仍是572nm和539nm不变。

2、具体操作步骤

取CO中毒心血（检材血）0.1ml~0.3ml，加10ml 0.1%硫化铵或多硫化铵水溶液（内含连二亚硫酸钠2.5mg/ml）稀释混匀，测定500nm~600nm之间的吸收图谱，用切线法量取555nm和540nm处的吸收值见图-2，计算血中HbCO% = F ×（A540/B555）×100公式，式中F为常数1.5；A540见图-2中a~b（cm）线段长；B555见图-2中c~d（cm）线段长。此法适合检材血中含量HbCO% > 40% 时效果好，此方法在办案中使用较多。

3、另一种经验方法

    适合各种CO浓度检材血的HbCO%测定，用0.4%氨水溶液稀释的含CO血在529nm和582nm处有吸收峰，稀释液做参比。根据经验公式：HbCO% = （A529－A582）×185/（A529－0.07）进行计算。185和0.07均为经验常数，本方法要求稀释检材血的吸光度值在0.4~0.6范围准确度高。