一、实验准备

hPSC诱导分化内耳类器官试剂盒（abs90132-1kit）

产品组成：

2、辅助试剂

3、实验耗材

 二、诱导流程图

三、试剂盒使用流程

①EB 形成（2 天）
1、hPSC 于基质胶包被的六孔板的一个孔，用Advance 人多能干细胞培养基培养增殖至 70-80%汇合度。
2、吸去Advance 人多能干细胞培养基。
3、孔中加入 1mL PBS（无钙镁离子）洗，吸去。
4、孔中加入 1mL 人多能干细胞消化液，37℃消化 3min。
5、将 20mL EB 形成培养基和 40μL EB 形成补充剂混合均匀获得 EB 形成wan全培养基。（注意：所用培养基均应提前在工作台放置 30min 以恢复室温，后面操作同理。）
6、消化完成后于显微镜下可看到克隆发白发亮。
7、吸去 人多能干细胞消化液，每孔加入 1mL EB 形成wan全培养基终止消化。
8、轻轻吹打孔内细胞 2-3 次，将 500uL 细胞悬液移至有 9mLEB 形成培养基的 15mL 离心管中。
9、100g 离心 5min，吸弃上清。
10、轻弹细胞沉淀液，加入一毫升 EB 形成wan全培养基重悬细胞，将细胞悬液加入 9mLEB 形成wan全培养基，重新制成细胞悬液。
11、将细胞悬液移至加样槽，使用多通道移液器种到超低吸附 96 板中，每孔 100μL，接种 96个孔，普通 96 孔板每孔加 100μL PBS，96 孔作为配平。
12、于低速水平离心机，850rpm/120g 离心 3min，将板放入 37℃，5%CO₂ 的培养箱，记为 D-2。
13、第 2 天(D-1）可以看到形成大小均一的 EB。每孔补充 100μL EB 形成培养基（不含补充剂），放入 37℃，5%CO₂ 的培养箱。
（注意：补充 EB 形成培养基后，可将多通道移液器枪头置于液面下轻轻吹打，在不影响到 EB的情况下混匀培养基。）

②EB 分化阶段（12 天）
14、D0，解冻补充剂 A，9.6mL 预冷的基础培养基 1 与补充剂 A、200μL Matrigel 混合均匀，恢复至室温后，按每孔 100μL 更换培养基，诱导 EB 分化，用多通道移液器轻轻吹打，使 EB悬浮。在 37℃，5%CO₂ 培养箱中培养 4 天。
15、D4，解冻补充剂 B，2.5mL 基础培养基 1+补充剂 B 混合均匀，按每孔 25μL，加到 96 孔板中，并轻轻移液 8-10 次混匀，使每孔培养基的终体积为 125μL，37℃，5%CO₂ 培养 4 天。
16、D8，解冻补充剂 C，2.5mL 基础培养基 1+补充剂 C 混合均匀，按每孔 25μL，加到 96 孔板中，并轻轻移液 8-10 次混匀，使每孔培养基的终体积为 150μL，将 96 孔板放回培养箱，37℃，5%CO₂ 培养 4 天。

③耳泡形成阶段（6 天）
17、D12，EB 诱导结束，准备好基础培养基 2（提前在冰上冷藏至少 30min）；或者，在 D11 上使基础培养基 2 存储在 4°C 过夜。Matrigel 提前与补充剂 D 于 4℃解冻，冷的基础培养基 2 与补充剂 D 混合均匀。将 200uL Matrigel 加入 20mL 冷的混合培养基中，反复吹打溶解 20 次，复温到室温。将 96 孔板中的聚集物转移到两个 100mm 培养皿中，每个培养皿中有 48 个聚集体。用 1-2mL 的 PBS 洗涤聚集体 2 次，再用 1mL 不含 Matrigel 的混合培养基洗涤 1 次，然后分别加入 10mL 含 Matrigel 的混合培养基，将培养皿放入培养箱中，37℃，5%CO₂ 培养 3天；D15 吸掉培养皿中的培养基，重新加入不含 Matrigel 的混合培养基，继续培养 3 天，诱导
耳泡形成；
（注意：10mm 皿一般换液需要 10mL 培养基）

④内耳类器官成熟阶段（42 天）
18、D18-60，内耳类器官逐渐成熟，将培养基换成成熟培养基，开始长期培养，每 5 天换一次液，到 60 天左右获得具有感觉毛细胞的成熟内耳类器官。

三、内耳类器官鉴定图

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