一、细胞特性与应用价值

永生化大鼠门静脉肌成纤维细胞（RGF）是经基因工程改造后获得永生化特性的细胞系。这些细胞不仅保留了正常肌成纤维细胞的收缩、分泌等基础功能，还具备持续增殖能力，为肝脏疾病研究等提供稳定细胞模型。在肝脏纤维化与再生领域，RGF细胞可用于探究肌成纤维细胞激活及参与组织修复机制，助力了解肝脏损伤后的病理生理变化。同时，它们也是药物筛选与毒性测试的优质体外模型，能快速评估药物对肌成纤维细胞生理功能的影响，为肝脏疾病药物研发提供实验依据。

二、细胞培养前的准备工作

（一）培养设备与器材检查

在进行细胞培养之前，对培养设备和器材进行全面检查是确保实验顺利进行的关键步骤。首先检查细胞培养箱，确认其温度、湿度和 CO? 浓度的控制系统是否正常。一般来说，细胞培养箱的温度应精准维持在 37℃，湿度需保持在 95% 左右，而 CO? 浓度则应稳定在 5%。这三个参数对于模拟细胞在体内的生长环境至关重要。如果发现培养箱的任何参数出现偏差，应立即进行校准或维修，以确保细胞能够在适宜的环境中生长。

显微镜是观察细胞形态和生长状态的工具。检查显微镜的目镜和物镜是否清洁无污，调节焦距的装置是否灵活有效。只有通过清洁且功能正常的显微镜，才能清晰准确地观察到细胞的细微结构，如细胞核的形状、细胞质的分布以及细胞间的连接情况等，从而及时发现细胞生长过程中的异常变化。此外，还需检查培养皿、离心管等耗材的质量。确保培养皿表面平整光滑、无划痕、无裂纹，离心管密封性能良好、无破损。使用前，对所有耗材进行高压灭菌处理（121℃，15 - 20 分钟）或直接使用无菌包装的一次性耗材，以防止细菌、真菌等微生物污染细胞，影响实验结果。

（二）培养基配制与灭菌

配制适合 RGF 细胞生长的培养基是细胞培养成功的另一个关键因素?；∨嘌ǔＱ≡?Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM），这些培养基含有细胞生长所需的基本营养成分，如碳水化合物、氨基酸和维生素等。除了基础培养基外，还需添加 10% - 15% 的胎牛血清（FBS），胎牛血清富含多种细胞生长因子、激素和黏附因子，能够为细胞提供丰富的营养支持，促进细胞的生长和增殖。同时，加入青霉素 - 链霉素溶液（100 U/ml 青霉素和 100 μg/ml 链霉素）以防止细菌和真菌的污染。

配制好的培养基需要进行高压蒸汽灭菌处理。将培养基分装到合适的容器中，设置压力为 100 - 105 kPa，温度为 121℃，灭菌 15 - 20 分钟。在灭菌过程中，要确保培养基不过度沸腾，以免造成成分的丢失或变性。灭菌完成后，将培养基调至 4℃保存，待使用前再恢复至室温，以保持培养基中各种成分的稳定性和活性。

三、细胞复苏的规范操作

从冻存状态复苏 RGF 细胞是细胞培养的起始步骤，正确的操作可以确保细胞的活性和正常生长。首先，准备一个 37℃左右的水浴锅，将含有冻存细胞的冻存管从液氮罐中迅速取出，立即放入水浴锅中，并用镊子快速摇动冻存管，使细胞在 1 - 2 分钟内全融化?？焖偃诨梢宰畲笙薅鹊丶跎傧赴诘臀碌匠Ｎ鹿讨惺艿降乃鹕耍岣呦赴母此章?。

然后，用 75% 的酒精对冻存管外部进行消毒，以防止外界细菌、真菌等微生物污染细胞。在无菌操作台内，将冻存管内的细胞悬液快速加入到含有适量培养基的离心管中，轻轻吹打混匀，使细胞均匀分散在培养基中。接下来进行离心操作，一般设定离心速度为 1000 - 1200rpm，离心时间为 5 分钟左右，使细胞沉淀到离心管底部。离心完成后，小心弃去上清液，注意不要倒掉沉淀的细胞。加入新鲜的培养基，用移液管轻轻吹打细胞沉淀，使其重新悬浮在培养基中。将细胞悬液转移至培养皿中，轻轻晃动培养皿，使细胞均匀分布在整个培养皿表面，放入 37℃、5% CO? 的细胞培养箱中静置培养，让细胞逐渐恢复活性并开始贴壁生长。在复苏后的 24 小时内，要密切观察细胞的生长状态，及时更换培养基，以确保细胞能够顺利适应新的培养环境。

四、细胞培养过程中的观察与记录

定期观察 RGF 细胞的生长状态是细胞培养过程中的重要环节。通常每天至少观察一次细胞，观察内容包括细胞的形态、颜色、细胞密度以及培养基的情况等。正常生长的 RGF 细胞呈梭形或纺锤形，细胞边缘清晰，胞质均匀，颜色为淡黄色或透明，细胞之间相互连接成网状结构。当细胞生长良好时，细胞密度会逐渐增加，培养基的颜色可能会因为细胞代谢而略有变化，如由红色逐渐变为橙色或淡黄色。

若观察到细胞颜色变深、浑浊，或者出现大量漂浮物，则可能提示细胞受到细菌、真菌或支原体等微生物的污染，或者细胞已经死亡、变性。此时需要立即进行处理，如更换培养基、使用抗生素等，严重污染的细胞可能需要丢弃，以防止污染扩散到其他细胞培养体系中。

同时，要详细记录细胞的生长情况，包括细胞的形态变化、细胞密度的估计值（如以细胞占据培养皿面积的百分比表示）、培养基的更换时间、细胞传代的时间和比例等信息。这些记录有助于了解细胞的生长规律，为后续实验安排提供参考，也有助于在出现问题时追溯原因，及时调整培养条件或采取相应的解决措施。例如，通过观察细胞在不同培养基成分下的生长情况，可以优化培养基配方，提高细胞的生长质量和实验重复性。

五、细胞传代的详细步骤

当 RGF 细胞生长到培养皿面积的 80% - 90% 左右时，需要进行传代操作，以避免细胞因密度过高而出现接触抑制，影响细胞的正常生长和功能。传代前，先用磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻冲洗培养皿中的细胞，目的是去除细胞表面残留的培养基和一些可能影响细胞传代的杂质。冲洗时，将适量的 PBS 缓慢加入培养皿，轻轻晃动培养皿使 PBS 均匀覆盖细胞表面，然后将 PBS 缓慢倾斜倒出，注意不要用力冲刷细胞，以免对细胞造成损伤。

接着，加入适量的胰蛋白酶 - EDTA 溶液（常用浓度为 0.25% 胰蛋白酶和 0.02% EDTA）到培养皿中，胰蛋白酶可以分解细胞间的黏附分子，使细胞从培养皿表面脱落。将培养皿放入 37℃、5% CO? 的培养箱中孵育 1 - 2 分钟，期间要不时在显微镜下观察细胞是否开始脱落。若细胞未全脱落，可轻轻敲击培养皿的侧壁，帮助细胞脱离培养皿表面。当细胞大部分脱落形成细胞悬液后，立即加入适量的含血清培养基终止胰蛋白酶的作用，因为胰蛋白酶作用时间过长会对细胞造成损伤，影响细胞的活性和后续生长。

将细胞悬液转移至离心管中，进行离心（条件同前），弃去上清液后，加入新鲜的培养基，用移液管轻轻吹打，使细胞均匀分散在培养基中。按照适当的比例（如 1:2 或 1:3）将细胞悬液分配到新的培养皿中，轻轻晃动培养皿使细胞均匀分布，放入培养箱继续培养。传代后的细胞需要特别关注前 24 小时的生长状态，观察细胞是否能够正常贴壁、恢复生长，如有异常及时采取措施，如调整培养基成分、优化培养条件等，以确保细胞的健康生长和实验的顺利进行。

六、细胞冻存的标准化流程

对于多余的细胞或需要长期保存的细胞系，冻存是常用的保存方法。冻存前，先用胰蛋白酶消化细胞并收集细胞悬液，离心后弃去上清液。加入适量的冻存液（一般冻存液的成分为 90% 胎牛血清和 10% 二甲基亚砜（DMSO）），轻轻吹打使细胞均匀分散在冻存液中。将细胞悬液分装至冻存管中，每管一般装 1 - 1.5ml。然后将冻存管放入程序降温盒中，使细胞缓慢降温。如果没有程序降温盒，可采用手动降温的方法：先将冻存管放置在 4℃环境下 30 分钟，再转移到 - 20℃环境下放置 1 - 2 小时，最后转移到 - 80℃冰箱中保存 2 - 3 小时，之后迅速将冻存管转移到液氮罐中长期保存。这种缓慢降温的程序可以减少细胞内冰晶的形成，降低细胞在冻存过程中受到的损伤，提高细胞的复苏率。在冻存过程中，要注意保持冻存管的密封性，防止水分进入导致细胞受损，同时做好冻存管的标记，注明细胞名称、冻存日期等信息，以便后续使用时能够快速准确地找到所需的细胞。

七、细胞实验应用的操作要点

（一）细胞迁移与侵袭实验操作

RGF 细胞在肝脏纤维化等病理过程中涉及细胞迁移和侵袭行为。细胞迁移与侵袭实验可用于研究影响细胞运动能力的各种因素。常用的实验方法有 Transwell 小室实验和划痕实验。

在 Transwell 小室实验中，上层小室的底部铺有一层聚碳酸酯膜，该膜上可以涂有或不涂有细胞外基质成分（如胶原蛋白、纤维连接蛋白等），以模拟体内细胞迁移的微环境。下层小室中加入含有一定浓度细胞因子或药物的培养基作为化学趋向因子，吸引上层小室中的细胞向下游迁移或侵袭。将 RGF 细胞种植到上层小室中，放入培养箱孵育一定时间（如 12 - 24 小时）。孵育结束后，用棉签轻轻擦去上层小室表面未迁移或侵袭的细胞，对迁移或侵袭至下层小室或膜下表面的细胞进行固定、染色，然后在显微镜下计数。通过比较不同实验组和对照组的迁移或侵袭细胞数量，可以评估各种因素对细胞运动能力的影响。

划痕实验则是在细胞铺满培养皿后，用无菌的细尖头物在细胞层上划痕，制造出细胞空白区域。随后用 PBS 轻洗，去除划痕边缘的悬浮细胞。将培养皿置于培养箱中孵育，不同时间点取出观察并拍照，记录细胞迁移填补划痕的情况。通过测量划痕宽度的变化或计算迁移细胞的数量，可以定量分析细胞的迁移能力。

（二）细胞因子分泌检测实验操作

RGF 细胞会分泌多种细胞因子，在调节细胞行为、免疫反应等方面起着重要作用。通过检测 RGF 细胞分泌的细胞因子，可以深入了解其在不同刺激条件下的功能状态。常用的细胞因子检测方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）和蛋白质芯片等。

在进行 ELISA 检测时，首先根据实验需求选择合适的细胞因子检测试剂盒，如检测大鼠 TGF - β（转化生长因子 - β）或 PDGF（血小板衍生生长因子）等细胞因子。将 RGF 细胞培养至一定密度后，用不含血清的培养基孵育细胞一段时间（如 24 - 48 小时），收集上清液作为待测样本。按照试剂盒说明书的操作步骤，将样本加入到预先包被有特异性抗体的酶标板孔中，经过孵育、洗涤、加入酶标记二抗、显色反应等步骤，最后通过酶标仪测定吸光度值，根据标准曲线计算出细胞因子在样本中的浓度。通过比较不同处理组和对照组的细胞因子分泌水平，可以分析各种因素（如药物、炎症因子等）对 RGF 细胞分泌功能的影响，从而探讨其在肝脏疾病发生发展中的作用机制，为开发新的治疗策略提供线索。

（三）细胞与材料相互作用实验操作

在组织工程研究中，研究 RGF 细胞与生物材料的相互作用是一个关键环节。将 RGF 细胞种植到不同的生物材料表面（如生物可降解材料、组织工程支架等），可以观察细胞在材料表面的黏附、增殖、分化以及细胞外基质分泌等情况，从而评估材料的生物相容性和对组织修复的支持作用。

在进行这类实验时，首先需要对生物材料进行适当的处理和灭菌，确保材料表面清洁、无毒且适合细胞生长。将材料样品放置在培养皿或细胞培养板中，然后将细胞以适当的密度接种到材料表面。在细胞培养箱中孵育一段时间后，通过扫描电子显微镜观察细胞在材料表面的形态和分布情况，了解细胞与材料的初始黏附状态。同时，可以采用一系列的细胞生物学检测方法，如细胞计数试剂盒（CCK - 8）检测细胞的增殖情况，免疫荧光染色检测细胞骨架蛋白（如 F - actin）的排列和相关分化标志蛋白的表达等，综合评估细胞与材料之间的相互作用效果。通过这些实验，可以筛选出适合组织工程应用的生物材料，优化材料的表面特性或组成，以提高细胞的活性和功能，加速组织的修复和再生过程。