一、细胞特性与应用价值

永生化人牙周膜成纤维细胞 - SV40 是一种经过特殊处理的细胞系，其通过将 SV40 大 T 抗原导入人牙周膜成纤维细胞而获得永生化特性。这种细胞系保留了正常人牙周膜成纤维细胞的部分生物学特性，同时具备无限增殖的能力，为牙周组织相关的研究提供了稳定的细胞模型。

在牙周组织工程领域，它们可用于研究牙周组织的再生机制，例如探索不同生物材料与成纤维细胞相互作用对牙周组织修复的影响。在药物筛选方面，可用于测试新型药物对牙周膜成纤维细胞生理功能（如增殖、迁移、分化等）的作用，从而为牙周疾病治疗药物的研发提供实验依据。另外，对于研究牙周膜成纤维细胞在牙周炎等疾病发生发展过程中的细胞学变化和分子机制，该细胞系也具有重要的应用价值。

二、细胞培养前的准备工作

（一）培养设备与器材检查

在开始细胞培养之前，需要对细胞培养所需的设备和器材进行全面的检查。细胞培养箱是维持细胞生长环境的关键设备，应确保其温度、湿度和 CO?浓度的控制精准且稳定。一般设定温度为 37℃，湿度保持在 95% 左右，CO?浓度为 5%。检查培养箱的水盘是否有足够的水，以维持湿度；同时观察培养箱内的温度和 CO?浓度是否在设定范围内，如有偏差及时进行校准。

显微镜是观察细胞形态和生长状态的重要工具，需检查其目镜和物镜是否清洁，调节焦距的功能是否正常，以确保能够清晰准确地观察细胞的各种细节，如细胞的形态、大小、细胞核的状态以及是否有污染等情况。

培养皿、离心管等耗材的质量也会影响细胞培养的结果。检查培养皿的表面是否光滑、平整，有无划痕、裂纹等缺陷；离心管是否密封良好，有无破损。使用前，所有耗材都应按照要求进行灭菌处理，一般采用高压灭菌（121℃，15 - 20 分钟）或使用无菌包装的一次性耗材，以避免细菌、真菌等微生物污染细胞。

（二）培养基配制与灭菌

永生化人牙周膜成纤维细胞 - SV40 的培养基通常由基础培养基和多种添加成分组成。常用的基础培养基为 Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）或 Minimum Essential Medium（MEM）。这些基础培养基提供了细胞生长所需的基本营养成分，包括碳水化合物、氨基酸、维生素等。

在基础培养基的基础上，需要添加适量的胎牛血清（FBS），一般添加比例为 10% - 15%。胎牛血清富含多种细胞生长因子、激素、黏附因子等，能够促进细胞的生长和增殖，同时为细胞提供一个类似于体内环境的营养支持。此外，还需要加入青霉素 - 链霉素溶液（通常浓度为 100 U/ml 青霉素和 100 μg/ml 链霉素），以防止细菌和真菌的污染。部分实验室还会根据实验需求添加其他成分，如胰岛素、表皮生长因子等，以优化细胞的生长环境。

配制好的培养基需要进行灭菌处理，一般采用高压蒸汽灭菌法。将培养基分装到合适的容器中，设置压力为 100 - 105 kPa，温度为 121℃，灭菌 15 - 20 分钟。在灭菌过程中，要注意防止培养基过度沸腾导致成分丢失或变性。灭菌完成后，将培养基调至 4℃保存，待使用前再恢复至室温。

三、细胞复苏的规范操作

从冻存状态复苏细胞是细胞培养的起始步骤，正确的操作可以保证细胞的活性和正常生长。首先，准备一个 37℃左右的水浴锅，将含有冻存细胞的冻存管从液氮罐中迅速取出，立即放入水浴锅中，并用镊子快速摇动冻存管，使细胞在 1 - 2 分钟内融化?？焖偃诨梢跃×考跎傧赴诘臀碌匠Ｎ鹿讨惺艿降乃鹕?，提高细胞的复苏率。

然后，用 75% 的酒精对冻存管外部进行消毒，避免外界细菌、真菌等微生物污染细胞。在无菌操作台内，将冻存管内的细胞悬液快速加入到含有适量培养基的离心管中，轻轻吹打混匀，使细胞均匀分散在培养基中。接下来进行离心操作，一般设定离心速度为 1000 - 1200rpm，离心时间为 5 分钟左右，使细胞沉淀到离心管底部。离心完成后，小心弃去上清液，注意不要倒掉沉淀的细胞。加入新鲜的培养基，用移液管轻轻吹打细胞沉淀，使其重新悬浮在培养基中。将细胞悬液转移至培养皿中，轻轻晃动培养皿，使细胞均匀分布在整个培养皿表面，放入 37℃、5% CO?的细胞培养箱中静置培养，让细胞逐渐恢复活性并开始贴壁生长。

四、细胞培养过程中的观察与记录

定期观察细胞的生长状态是细胞培养过程中的重要环节。通常每天至少观察一次细胞，观察内容包括细胞的形态、颜色、细胞密度以及培养基的情况等。正常生长的永生化人牙周膜成纤维细胞 - SV40 细胞呈长梭形或多边形，细胞边缘清晰，胞质均匀，颜色为淡黄色或透明，细胞之间相互连接成网状结构。当细胞生长良好时，细胞密度会逐渐增加，培养基的颜色可能会因为细胞代谢而略有变化，如由红色逐渐变为橙色或淡黄色。

若观察到细胞颜色变深、浑浊，或者出现大量漂浮物，则可能提示细胞受到细菌、真菌或支原体等微生物的污染，或者细胞已经死亡、变性。此时需要立即进行处理，如更换培养基、使用抗生素等，严重污染的细胞可能需要丢弃，防止污染扩散到其他细胞培养体系中。

同时，要详细记录细胞的生长情况，包括细胞的形态变化、细胞密度的估计值（如以细胞占据培养皿面积的百分比表示）、培养基的更换时间、细胞传代的时间和比例等信息。这些记录有助于了解细胞的生长规律，为后续实验安排提供参考，也有助于在出现问题时追溯原因，及时调整培养条件或采取相应的解决措施。

五、细胞传代的详细步骤

当永生化人牙周膜成纤维细胞 - SV40 生长到培养皿面积的 80% - 90% 左右时，需要进行传代操作，以避免细胞因密度过高而出现接触抑制，影响细胞的正常生长和功能。

传代前，先用磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻冲洗培养皿中的细胞，目的是去除细胞表面残留的培养基和一些可能影响细胞传代的杂质。冲洗时，将适量的 PBS 缓慢加入培养皿，轻轻晃动培养皿使 PBS 均匀覆盖细胞表面，然后将 PBS 缓慢倾斜倒出，注意不要用力冲刷细胞，以免对细胞造成损伤。

接着，加入适量的胰蛋白酶 - EDTA 溶液（常用浓度为 0.25% 胰蛋白酶和 0.02% EDTA）到培养皿中，胰蛋白酶可以分解细胞间的黏附分子，使细胞从培养皿表面脱落。将培养皿放入 37℃、5% CO?的培养箱中孵育 1 - 2 分钟，期间要不时在显微镜下观察细胞是否开始脱落。若细胞未全脱落，可轻轻敲击培养皿的侧壁，帮助细胞脱离培养皿表面。当细胞大部分脱落形成细胞悬液后，立即加入适量的含血清培养基终止胰蛋白酶的作用，因为胰蛋白酶作用时间过长会对细胞造成损伤，影响细胞的活性和后续生长。

将细胞悬液转移至离心管中，进行离心（条件同前），弃去上清液后，加入新鲜的培养基，用移液管轻轻吹打，使细胞均匀分散在培养基中。按照适当的比例（如 1:2 或 1:3）将细胞悬液分配到新的培养皿中，轻轻晃动培养皿使细胞均匀分布，放入培养箱继续培养。传代后的细胞需要特别关注前 24 小时的生长状态，观察细胞是否能够正常贴壁、恢复生长，如有异常及时采取措施。

六、细胞冻存的标准化流程

对于多余的细胞或需要长期保存的细胞系，冻存是常用的保存方法。冻存前，先用胰蛋白酶消化细胞并收集细胞悬液，离心后弃去上清液。加入适量的冻存液（一般冻存液的成分为 90% 胎牛血清和 10% 二甲基亚砜（DMSO）），轻轻吹打使细胞均匀分散在冻存液中。将细胞悬液分装至冻存管中，每管一般装 1 - 1.5ml。然后将冻存管放入程序降温盒中，使细胞缓慢降温。如果没有程序降温盒，可采用手动降温的方法：先将冻存管放置在 4℃环境下 30 分钟，再转移到 - 20℃环境下放置 1 - 2 小时，最后转移到 - 80℃冰箱中保存 2 - 3 小时，之后迅速将冻存管转移到液氮罐中长期保存。这种缓慢降温的程序可以减少细胞内冰晶的形成，降低细胞在冻存过程中受到的损伤，提高细胞的复苏率。

七、细胞实验应用的操作要点

（一）基因转染实验操作

该细胞系常用于基因转染实验，以研究特定基因在细胞中的功能。在进行基因转染前，要确保细胞处于良好的生长状态，细胞密度在 70% - 80% 左右较为合适。对于质粒转染，常用脂质体介导的转染方法。首先，将质粒 DNA 和脂质体转染试剂按照一定比例（如 1:2 或 1:3）在无血清培养基中混合，室温孵育 15 - 30 分钟，使脂质体与质粒形成转染复合物。然后将转染复合物加入到细胞培养皿中，轻轻晃动培养皿使复合物均匀分布。转染后 6 - 8 小时，可更换为含有血清的培养基，以维持细胞的正常生长。一般在转染后 24 - 72 小时，根据所转染基因的特点和实验需求，通过荧光显微镜观察转染效率（如果质粒携带荧光报告基因）或进行相关基因功能检测实验，如检测基因表达水平（采用实时荧光定量 PCR 或 Western blot 等方法）或细胞生物学功能变化（如细胞增殖、迁移、分化等实验）。

（二）细胞迁移实验操作

永生化人牙周膜成纤维细胞 - SV40 在牙周组织的修复和再生过程中，其迁移能力是一个重要的生物学功能。细胞迁移实验可用于研究影响细胞迁移的各种因素，如细胞外基质成分、细胞因子、药物等。常用的细胞迁移实验方法有划痕实验和 Transwell 小室实验。

在划痕实验中，待细胞在培养皿中生长至接近 confluent（即细胞几乎铺满培养皿表面）时，使用无菌的 10μl 移液枪头或细胞刮刀在细胞层中央轻轻划一条直线，制造一个细胞空白区域，即“划痕”。用 PBS 小心冲洗培养皿，去除划痕处脱落的细胞碎片，然后加入不含血清的培养基（因为血清中的某些成分可能会刺激细胞增殖，干扰迁移结果的判断）。将培养皿放入培养箱中，在不同时间点（如 0 小时、6 小时、12 小时、24 小时等）取出培养皿，在显微镜下拍照记录划痕处细胞的迁移情况。通过测量划痕宽度的变化或计算迁移细胞的数量，可以定量分析细胞的迁移能力。

Transwell 小室实验则是在一个特殊的双层培养装置中进行。上层小室的底部铺有一层聚碳酸酯膜，该膜上可以涂有或不涂有细胞外基质成分（如胶原蛋白、纤维连接蛋白等），以模拟体内细胞迁移的微环境。下层小室中加入含有一定浓度细胞因子或药物的培养基作为化学趋向因子，吸引上层小室中的细胞向下游迁移。将永生化人牙周膜成纤维细胞 - SV40 种植到上层小室中，放入培养箱孵育一定时间（如 12 - 24 小时）。孵育结束后，用棉签轻轻擦去上层小室表面未迁移的细胞，对迁移至下层小室或膜下表面的细胞进行固定、染色，然后在显微镜下计数。通过比较不同实验组和对照组的迁移细胞数量，可以评估各种因素对细胞迁移的影响。

（三）细胞与材料相互作用实验操作

在牙周组织工程研究中，研究细胞与生物材料的相互作用是一个关键环节。将永生化人牙周膜成纤维细胞 - SV40 种植到不同的生物材料表面（如羟基磷灰石、聚乳酸 - 羟基乙酸共聚物等），可以观察细胞在材料表面的黏附、增殖、分化以及细胞外基质分泌等情况，从而评估材料的生物相容性和对牙周组织修复的支持作用。

在进行这类实验时，首先需要对生物材料进行适当的处理和灭菌，确保材料表面清洁、无毒且适合细胞生长。将材料样品放置在培养皿或细胞培养板中，然后将细胞以适当的密度接种到材料表面。在细胞培养箱中孵育一段时间后，通过扫描电子显微镜观察细胞在材料表面的形态和分布情况，了解细胞与材料的初始黏附状态。同时，可以采用一系列的细胞生物学检测方法，如细胞计数试剂盒（CCK - 8）检测细胞的增殖情况，阿尔辛蓝染色检测细胞外基质中糖胺聚糖的分泌量，免疫荧光染色检测细胞骨架蛋白（如 F - actin）的排列和相关分化标志蛋白（如 collagen type I）的表达等，综合评估细胞与材料之间的相互作用效果，进而优化生物材料的性能，为牙周组织工程的临床应用提供实验依据。