骨重塑：指的是破骨细胞清除旧骨或受损骨质，并由成骨细胞形成的新骨取代的过程。

骨骼，是一种动态组织。其在人的整个生命过程中是不断被重塑的。持续重塑是维持骨骼关键功能所必需的，它能防止骨损伤的积累，并维持骨骼的机械强度和钙稳态^[1]。

骨重塑过程由破骨细胞和成骨细胞的“交流”来调控完成^[2]。

• 破骨细胞 (osteoclasts，OCs)：是一种骨吸收细胞，源自造血干细胞，它通过分泌酸性酶和蛋白水解酶来降解骨质。

• 成骨细胞 (Osteoblasts，OBs)：是一种骨形成细胞，它由间充质前体细胞在转录因子的连续作用下分化为骨祖细胞谱系而产生，并最终分化为骨细胞。

图 1. 破骨细胞生成和成骨细胞生成的策略^[1]。

骨矿化：指的就是钙的沉淀过程。钙、磷等无机盐沉淀在骨头组织的过程，就叫骨的矿化。

简单说，矿化是进化过程中的一种被动选择。

生物矿化的起源可以追溯到前寒武纪晚期，当时构造活动导致海水中可溶性矿物显著增加。人们普遍认为，海洋生物首先发展出由碳酸钙和/或磷酸钙矿物组成的原始外骨骼，渐渐地，骨骼组织被内化?？蠡趋狼看蟮某兄啬芰κ沟么笮图棺刀锏靡越?sup>[3]。

作为一种特殊的结缔组织，骨骼具有高度矿化的结构和构造。一方面，作为内部支撑系统，骨骼可为身体提供结构基础，并为运动提供肌肉附着点。同时，骨骼还?；ご竽院湍谠嗥鞴伲⑽撬柙煅橹峁┏∷?。此外，骨骼也是无机离子 (尤其是磷酸盐和钙) 的主要来源和储存地，它们能够积极参与体内矿物质稳态和能量代谢^[4]。

骨吸收：指的是骨钙溶出的过程。也就是把钙从骨头里面“搬”出来。破骨细胞将硬骨组织分解为矿物质，同时将骨骼中的钙释放至血液中。

破骨细胞是仅有的明确可降解骨的细胞，在骨稳态和健康维持中至关重要。

破骨细胞是一种组织特异性的多核巨噬细胞，由血液及骨髓中的单核/巨噬细胞系分化而来 (图 2)。其分化过程经历破骨细胞前体 (osteoclast precursor cells，OPCs，或称 preosteoclasts)、融合的多核破骨细胞 (non-functional polykaryons)、成熟破骨细胞 (mature osteoclasts，也称极化的多核破骨细胞) 等几个阶段。

               

如图 2 所示，M-CSF（CSF-1）和 RANKL 对破骨细胞生成至关重要，二者缺一不可。OPG 可以结合并中和 RANKL，从而负向调节破骨细胞生成和成熟破骨细胞的活化。

目前，已有大量实验证实破骨细胞形成和功能失调与骨质疏松症、骨折愈合、骨关节炎和原发性/转移性骨肿瘤等密切相关^[2]。体外诱导破骨细胞分化对研究骨代谢疾病、药物筛选具有重要作用。

实验方案

2. BMMs 贴壁筛选

(1) 用 5 mL 含 10% FBS  的 α-MEM 培养基重悬，离心，弃上清。

(2) 用 5 mL 含 M-CSF (25 ng/mL) 和 10% FBS 的 α-MEM 培养基重悬细胞。接种于 6 孔细胞培养板中 (每只小鼠一孔)，置于 37°C、5% CO₂ 细胞培养箱中培养过夜。

(3) 收集上清离心，弃上清液 (主要为红细胞和粒细胞)，用 5 mL 含有 50 ng/mL M-CSF 的培养基重悬后，以 5×10⁴ cells/孔的密度接种于 24 孔板中 (每孔 1 mL)，2-3 天后贴壁细胞即为骨髓来源巨噬细胞；

3. 破骨细胞诱导分化

(1) 弃上清液，用无菌 PBS 清洗 2 次。使用含有 50 ng/mL M-CSF 和 50 ng/mL RANKL 的培养基进行诱导分化；

(2) 细胞每 3 天换一次液，并补加因子 25 ng/mL M-CSF 和 50 ng/mL RANKL，4-6 天后进行诱导鉴定。

MCE 客户验证

实验方案

MCE 客户验证

1. 多核巨细胞

破骨细胞产生许多酶，其中主要是抗酒石酸酸性磷酸酶 (tartrate-resistant acidic phosphatase, Trap)，Trap 特异地分布于破骨细胞中，通常作为鉴别破骨细胞的重要标志物。

【实操步骤】

• 细胞样本 (以 48 孔板为例)：

(1) 移除细胞培养液，每孔加入 400 μL PBS 清洗，弃液。

(2) 每孔加入 300 μL 4% 多聚甲醛溶液，室温固定 15-30 min，弃液。

(3) 每孔加入 300 μL PBS，清洗 2 次。

(4) 染色：每孔加入 150-200 μL TRAP 染色液，37℃ 避光孵育 10-15 min (待测样品中酒石酸酸性磷酸酶活性较低时，可适当延长孵育时间至 30 分钟或显微镜下显色至预期深浅)。

(5) 每孔加入 300 μL PBS，清洗 2 次。

(6) 显微镜下观察和拍照。

2. 骨吸收实验

(1) RAW264.7 细胞在含有 10% FBS 的 RPMI-1640 或 DEME 培养基中可以增殖并保持其分化为破骨细胞的能力，而其在含有 10% FBS 的 α-MEM 中培养可进行破骨细胞分化试验。

(2) RAW264.7 分化为破骨细胞的成功与否与细胞状态密切相关，建议使用 15 代以内的 RAW264.7 细胞。

(3) 分化诱导培养基工作液建议现配现用，使用前注意 37 ℃ 温育。

(4) 使用的 RANKL 和 M-CSF 浓度可能因小鼠和实验室条件而异。

(5) 破骨细胞形成初期，细胞呈纺锤形，成熟后，细胞变大，多核，呈圆形。从 RANKL 和 M-CSF 添加后的第 4 天起，每天至少观察一次细胞，因为小鼠破骨细胞在分化后非常不稳定。

(6) 诱导成功后立即进行染色，小鼠破骨细胞在成熟后 24 h 内死亡。

产品推荐

RANKL/TNFSF11 Protein, Mouse (HY-P7425) RANKL 是 RANK 的激活剂。当与 RANK 结合后，其诱导单核细胞/巨噬细胞谱系细胞分化为破骨细胞，并进一步导致破骨细胞前体成熟。

M-CSF Protein, Mouse (HY-P7085) M-CSF 是调节造血前体细胞（特别是单核吞噬细胞，包括巨噬细胞和单核细胞）存活、增殖和分化的关键协调因子。

TNFRSF11B/OPG Protein, Mouse (HEK293, His) (HY-P71017) 竞争性抑制 RANKL-RANK 结合，负调控破骨细胞生成。

Red Blood Cell Lysis Buffer (HY-3010) 即用型溶液，能快速、有效的从人或鼠等的血液或组织样品中裂解并去除无核红细胞，不影响白细胞、正常组织或肿瘤细胞。

DMEM (High Glucose, L-Glutamine, Pyruvate, Phenol Red, no HEPES) (HY-K3001) 广泛使用的基础培养基。

Rhodamine Phalloidin (HY-K0903) 罗丹明偶联的 Phalloidin，检测细胞骨架肌动蛋白结构的形成。

TRAP Antibody (YA2321) (HY-P82576) 适用于 Human, Mouse, Rat 的 WB, IHC-P, ICC/IF, IP。

NFAT2 Antibody (HY-P80243) 适用于 Human 的 WB, IHC-P, FC。

 

[1] Kim JM, et al. Osteoblast-Osteoclast Communication and Bone Homeostasis. Cells. 2020 Sep 10;9(9):2073. 

[2] DONG Shiwu, et al. Break and then stand: novel insight into osteoclast functions in the skeletal system[J]. Journal of Army Medical University, 2022, 44(1): 79-88. 

[3] Murshed M. Mechanism of Bone Mineralization. Cold Spring Harb Perspect Med. 2018 Dec 3;8(12):a031229. Erratum in: Cold Spring Harb Perspect Med. 2020 Aug 3;10(8):a040667. 

[4] Shi C,et al. Recent advances in bone-targeted therapy. Pharmacol Ther. 2020 Mar;207:107473. 

[5] Boyle WJ, et al. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 2003 May 15;423(6937):337-42. 

[6] Toda G, et al. Preparation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice for functional analysis. STAR Protoc. 2020 Dec 31;2(1):100246. 

[7] Sun W, et al. Sulforaphane inhibits multiple myeloma cell-induced osteoclast differentiation and macrophage proliferation by elevating ferroportin1. Cancer Chemother Pharmacol. 2024 Dec 11;95(1):3.

[8] Wen L, et al. TFAP2B governs the regulation of SIRT1 to inhibit osteoclast-induced bone destruction. Biochem Biophys Res Commun. 2025 Mar 8;752:151410.

[9] Yin S, et al. Dominoes with interlocking consequences triggered by zinc: involvement of microelement-stimulated MSC-derived exosomes in senile osteogenesis and osteoclast dialogue. J Nanobiotechnology. 2023 Sep 23;21(1):346.