文章来源公众号：一毛的生命科学      作者：科研不过名利场

一个人很容易受制于先前的固定经验，比如我之前做异体CAR的，相比于自体CAR细胞的一个优势就是患者的免疫细胞比如T细胞不好使，没有健康的人细胞牛，所以当看到体内制备火热的时候（各种公众号都在发，很容易随机刷到），所以脑海里第一个问题就是患者的T细胞不好使是做异体CAR的其中一个优势，到体内CAR制备就好使了？所以下面来了解一下体内制备，做个知识补充。

1. 体内 CAR-T 的原理及传统 CAR-T 的区别

传统 CAR-T 制备（自体/异体）：目前已上市的 CAR-T 疗法大多采用自体模式，即从患者自身采集 T 细胞，经体外基因改造使其表达嵌合抗原受体（CAR），大量扩增后再回输体内。这一过程通常需要数周时间和高昂成本（每例可能40万美元以上）。自体CAR-T的生产流程复杂（包括淋巴细胞分离、体外激活和转导、扩增培养、制剂质检等多个步骤）。同时，由于每名患者需定制，其物流和保存也具有挑战。异体CAR-T则尝试用健康供者的T细胞批量生产“现货”产品，以降低成本并提高可及性。异体CAR-T有望提供即取即用的细胞制品，但存在免疫相容性问题：供者T细胞的 TCR 可能攻击患者组织引发移植物抗宿主病 (GvHD)，反之患者免疫系统也可能清除外源CAR-T（宿主抗移植物反应），导致疗效下降。

体内 CAR-T 原理：体内CAR-T疗法的思路是直接在患者体内将其T细胞转变为CAR-T细胞，无需体外培养扩增。具体做法是将编码CAR结构的基因载体（如病毒载体或基因纳米颗粒）直接经静脉或局部注射给患者，使这些载体在体内转导患者自身的T淋巴细胞，从而让T细胞原位表达CAR受体。这样，患者体内的T细胞在体内被重编程为CAR-T并增殖发挥抗肿瘤作用。该方法跳过了繁琐的体外步骤，大大缩短治疗准备时间，理论上可实现“当天给药，当天体内生成CAR-T”。正如文献指出的，直接体内工程化T细胞可以wan全免除体外操作和扩增过程，将治疗细胞直接在体内生成。由于避免了个性化的体外制造流程，体内CAR-T有希望降低成本并提高可及性。而且，体内产生CAR-T可能减少某些系统性副作用，例如由于不需要大量回输活化细胞，细胞因子释放综合征（CRS）和神经毒性等发生率或严重程度可能降低。此外，体内转导利用的是患者自身细胞，因此和自体CAR-T一样不存在GVHD风险，也避免了患者对异体细胞的免疫排斥问题。

总之，体内CAR-T与传统CAR-T的核心区别在于制造方式：前者将基因疗法直接用于患者，使患者体内完成CAR-T的“生产”和扩增，而后者需要实验室中完成细胞改造和扩增再回输。这使得体内CAR-T有望成为一种标准化的“即用型”疗法，节省时间和成本。同时，绕过了多轮体外刺激扩增，体内生成的CAR-T细胞可能避免过度分化和疲竭，保留更原始的功能表型。这一点在后文将详述。

2. 体内 CAR-T 的递送系统及对 T 细胞亚群的靶向

实现体内CAR-T的关键在于高效安全地将CAR基因递送给体内的T细胞。目前主要有两大类载体系统：病毒载体和非病毒纳米载体，包括脂质纳米颗粒（LNP）等。不同系统在体内的转导效率和对T细胞亚群的选择性各有特点。

• 病毒载体：AAV 和慢病毒。重组腺相关病毒（AAV）因不整合基因组、可在体内长期表达而被认为是较安全的体内基因治疗载体。已有研究利用AAV载入CAR基因直接注射，小鼠实验中观察到免疫细胞被体内重编程表达CAR并导致肿瘤消退。不过AAV天然并不特异感染T细胞，在体内可能主要感染肝脏等组织；如何提高其对T细胞的靶向性是挑战。另外，慢病毒（LV）载体可插入较大基因并稳定整合，已广泛用于体外CAR-T制备。用于体内时，慢病毒的广谱嗜性需要调整。研究者开发了靶向T细胞的慢病毒包膜：例如在病毒表面融合抗体或scFv，使其只感染T细胞。有文献报道，通过在慢病毒包膜上结合抗-CD8的单链抗体并假型化病毒，能在小鼠体内选择性转导T细胞并生成CAR-T，随后在人源化小鼠中观察到B细胞被清除以及类似CRS的现象。这一结果证明了靶向慢病毒可直接在体内产生功能性CAR-T。此外，研究还开发了针对CD4或CD8受体的慢病毒载体，可实现对人源T细胞高效且特异的基因转移，将CAR基因几乎只导入目标T细胞亚群。通过这些受体定向的病毒载体，体内递送的特异性和效率大大提高，有望避免非T细胞受到感染。

• 非病毒载体：纳米颗粒（聚合物纳米粒、LNP等）。出于安全性和成本考虑，许多研究转向非病毒的基因递送策略。其中阳离子聚合物纳米颗粒和脂质纳米颗粒（LNP）是常用载体。早期一项研究shou次尝试了体内将核酸递送至T细胞：Smith等人使用带正电的聚(β-氨基酯)聚合物纳米颗粒包裹CAR质粒DNA，静脉注射小鼠后，观察到T细胞被体内编程为抗白血病的CAR-T。后续研究改用携带CAR mRNA的类似聚合物纳米颗粒，多次静脉给药能够在体内持续地产生CAR-T细胞，在人源性小鼠模型中对白血病、前列腺癌和乙肝相关肝癌等产生了显著的抗肿瘤效应，疗效与传统回输CAR-T相当。这一系列研究验证了聚合物纳米载体递送CAR基因的可行性。

  当前应用更广泛的是脂质纳米颗粒（LNP）技术。LNP由离子化阳离子脂质、辅脂质、PEG修饰脂质和胆固醇等组成，可高效包裹并递送信使RNA（mRNA）。将CAR编码mRNA用LNP包装，可在T细胞中瞬时表达CAR而无基因组整合风险。体外实验显示，离子化LNP转染T细胞的CAR表达效率和杀瘤活性与电转染相当，但对细胞活力的毒性更低。不过，未经修饰的LNP倾向于被肝脏摄取，静脉注射后大量颗粒进入肝细胞和脾脏巨噬细胞等。因此，提高LNP在体内对T淋巴细胞的特异靶向非常重要。幸运的是，纳米粒表面可以通过化学修饰增加靶向配体，例如连接针对T细胞表面分子的抗体或配体，使LNP选择性结合并进入T细胞。这种靶向LNP（tLNP）策略已在研究中取得进展：有报道显示，加载CAR mRNA的CD5靶向LNP在小鼠体内能够使循环T淋巴细胞高效表达CAR，并成功清除心脏纤维化模型中的致病成纤维细胞。最新发表的研究进一步证实了靶向特定T细胞亚群的 LNP的效果：例如，将抗体修饰的LNP专门递送至CD8^+ T细胞，可在体内将这些细胞转变为CAR-T。在人源化小鼠肿瘤模型中，此举显著控制了肿瘤生长；在食蟹猴模型中，给药后也观察到了B细胞被清除的反应。由此可见，精确定向的基因纳米载体能够在体内高效重编程特定亚群T细胞为CAR-T，实现预期的免疫杀伤功能。

综上，目前体内CAR-T的递送载体包括AAV、慢病毒等病毒系统和聚合物纳米粒、LNP等非病毒系统。提升对T细胞的靶向效率是所有系统面临的共同挑战和研发重点。靶向手段包括修改病毒衣壳/包膜的受体嗜性，以及在纳米颗粒表面附着抗体或配体。这些改进已使体内递送在动物模型中实现了对T细胞特异的高效率转导。随着技术进步，我们有望在人体内也实现安全、高效且可重复的CAR基因递送，使患者自身T细胞在体内被选择性改造成抗肿瘤的效应细胞。

3. 体内 CAR-T 在实体瘤中的研究进展

虽然CAR-T细胞在血液肿瘤中取得了突破性成功，但在实体瘤中的应用仍面临诸多困难。不过，体内CAR-T疗法为攻克实体瘤带来了一些新的希望。近年来，一系列动物实验和早期临床探索显示出体内CAR-T在实体瘤模型中的可行性和疗效：

• 动物模型研究：多项小鼠实验已验证体内CAR-T可对实体瘤产生抗肿瘤作用。其中，Parayath等人的研究利用聚合物纳米颗粒反复静脉注射，将编码前列腺特异抗原和肝癌相关抗原的CAR基因递送至T细胞，成功在小鼠体内产生CAR-T细胞，对人源前列腺癌和HBV相关肝细胞癌异种移植瘤实现了显著的抑制和消退，疗效与传统体外制备的CAR-T相当。另一项研究中，Zhou等设计了LNP同时递送IL-6的shRNA和抗CD19 CAR基因，在急性淋巴白血病的小鼠模型中，同样观察到体内产生的CAR-T细胞清除了肿瘤负荷，效果可比拟输注CAR-T。针对实体瘤抗原的探索也在进行：有研究报道将编码抗人间皮瘤抗原（比如间质细胞表达的靶标）的CAR mRNA装载入靶向性纳米颗粒，给予肿瘤荷瘤小鼠后体内生成的CAR-T细胞使肿瘤生长受到控制。此外，利用AAV病毒直接在体内制造CAR-T细胞也有初步成功：Nawaz等人将携带CAR基因的AAV注入肿瘤小鼠，诱导免疫细胞在体内表达CAR，结果观察到肿瘤明显缩小。这些前临床结果证明，无论是病毒载体还是纳米载体，均可用于在活体内产生功能性CAR-T细胞并对实体瘤实施打击。

• 临床研究进展：体内CAR-T疗法正从动物走向临床。2023年以来，已有公司启动了相关的人体试验。例如，Myeloid Therapeutics公司宣布开展shou例基于体内CAR的mRNA疗法临床试验，将合成mRNA（LNP封装）注射到患者体内，以使循环免疫细胞表达靶向TROP2的CAR，用于实体瘤治疗。这是针对上皮来源实体瘤的一种创新疗法。同一公司还推动了一种靶向GPC3（常见于肝细胞癌等）的体内CAR程序进入临床试验阶段。需要指出的是，这些疗法有的并非将CAR基因送入T细胞，而是体内重编程患者的先天免疫细胞（如单核/髓系细胞）表达CAR。例如，Myeloid Therapeutics的方案旨在让髓系细胞在体内表达抗TROP2 CAR，以发挥抗实体瘤作用。这种策略被称为体内CAR-巨噬细胞（CAR-M）的概念。然而，无论作用细胞类型如何，其核心都是通过体内递送基因来赋予患者自身免疫细胞以抗肿瘤的特异性。除了公司主导的临床试验，一些学术团队也在探索体内CAR-T在人类中的应用策略。目前已有报告的人体病例显示，体内生成CAR-T细胞能够在非人灵长类体内造成预期的生物学效应（如B细胞清除），为后续在人类的安全性和有效性研究奠定了基础。尽管截至目前针对实体瘤的体内CAR-T在临床上仍处于早期, 这些积极的进展暗示了其潜力：在未来，患者或许只需注射一支基因载体制剂，即可在体内产生可以攻击实体肿瘤的CAR-T细胞。

值得一提的是，体内CAR技术的拓展还包括在体内改造其它免疫细胞（如NK细胞、巨噬细胞）用于肿瘤免疫治疗。这些变体可能在实体瘤中发挥du特优势（例如CAR-巨噬细胞更易浸润肿瘤并吞噬肿瘤细胞）。虽然本篇聚焦CAR-T，但这些探索体现了体内CAR疗法的广泛应用前景。

4. 体内 CAR-T 疗效显著的可能原因

体内CAR-T疗法在一些研究中表现出令人鼓舞的效果，甚至在患者自身T细胞质量欠佳的情况下也取得疗效。那么，**为何体内制备的CAR-T细胞仍能发挥良好作用？**可能的原因包括以下几个方面：

• 原位转染激活和渐进增殖：在体内直接将CAR基因引入T细胞，本身可能对T细胞起到一定激活作用。例如，某些基因载体（如LNP的RNA分子）能触发先天免疫感应，使T细胞进入警觉状态。此外，与体外流程需要强烈刺激T细胞不同，体内转导后T细胞的扩增是在机体环境中逐步进行的。肿瘤相关抗原的持续存在将不断驱动CAR-T细胞增殖，但这种增殖相对温和而非一次性大量扩增，有利于避免细胞过度分化和衰竭。文献指出，体外反复刺激和扩增会导致CAR-T功能耗竭，而体内原位重编程的T细胞则未经过度操纵，且以更渐进的动力学增殖，或能克服传统CAR-T细胞的功能衰减。因此，体内产生的CAR-T可能保持更长的增殖活性和存续期，从而在患者体内持续发挥疗效。

• 优先转导有利的T细胞亚群：体内基因递送往往并非平均地转导所有T细胞，可能在无意中偏重于某些亚群。理想情况下，若载体更易感染初始/早期记忆T细胞，则生成的CAR-T具有更强的增殖力和持久性。研究表明，较幼稚的记忆表型T细胞（如干细胞样记忆T细胞 TSCM、中央记忆T细胞 TCM）能提供zhuo越的增殖和抗肿瘤能力，并持久存活，而终末分化效应T细胞则效果较弱。体内转导可能偏向于这些未分化wan全的T细胞：例如，静脉注射的载体容易接触循环中的na?ve T细胞和中央记忆T细胞，而严重耗竭的效应T细胞往往存在于肿瘤组织中且数量有限。因此，即便患者外周T细胞总体功能欠佳，只要有少量健康的记忆T细胞被转导成为CAR-T，它们就有潜力大量扩增并发挥效应。此外，如果通过特殊途径（例如局部肿瘤内注射载体），还能直接转导肿瘤浸润性的驻留记忆T细胞（TRM）。这些细胞原本就驻扎于肿瘤微环境，经过CAR改造后可以就地发动攻击，无需克服趋向肿瘤的迁移障碍。这种特定亚群T细胞的优先改造可能解释了为何体内CAR-T在一些模型中表现突出：它有效动员了蕞具增殖和存续潜力的一批T细胞来对抗肿瘤。

• 肿瘤微环境中的动态激活：体内产生的CAR-T细胞在肿瘤微环境（TME）中逐步活化，这种动态过程可能有利于疗效。一方面，CAR-T细胞在体内接触抗原是一个持续过程，不像体外扩增后回输时所有CAR-T同时大量涌入、瞬时高水平激活。相反，体内生成的CAR-T随着表达CAR受体逐渐开始识别肿瘤抗原，不同时间有不同亚群细胞被招募和活化，形成持续不断的攻势。这种梯度式的激活避免了单次过猛的免疫反应，降低了细胞因子风暴等风险，同时让CAR-T细胞得以长期轮番作战。另一方面，在肿瘤环境中，CAR-T细胞的激活可能得到额外的共刺激和辅助信号。例如，肿瘤组织中存在的抗原提呈细胞(APC)和辅助性T细胞，可以提供共刺激分子和促存活的细胞因子。当CAR-T在肿瘤部位被抗原刺激时，这些因素或能同步加强其功能。并且，CAR-T细胞每次杀伤肿瘤细胞后，会释放炎性因子并造成肿瘤细胞裂解，这种动态循环会逐渐改变肿瘤局部的免疫环境，使其更有利于免疫攻击。总之，体内CAR-T的效果并非一蹴而就，而是在肿瘤环境中持续诱导和放大，这种动态过程可能比体外扩增后集中回输的方式更加协调有效。

• 与机体免疫微环境的协同：由于体内CAR-T疗法通常不需强预处理（如不需要大剂量淋巴清除性化疗），患者自身的免疫系统在治疗时相对完整。这意味着，当CAR-T细胞在体内发挥作用时，机体原有的免疫细胞也可参与协同作战。举例来说，CAR-T细胞消灭肿瘤后释放的肿瘤抗原碎片，可被患者体内的树突状细胞等摄取并呈递给天然的T淋巴细胞，从而诱导针对多种肿瘤抗原的二次免疫反应（称为表位扩展）。这有望动员非CAR的内源性T细胞一同攻击肿瘤，弥补CAR靶向的局限。与此同时，CAR-T细胞产生的细胞因子（如IFN-γ、TNF等）会使肿瘤微环境由“冷”变“热”，促进肿瘤内的巨噬细胞、NK细胞等发挥抗肿瘤活性，并提高肿瘤细胞对免疫攻击的易感性。例如，IFN-γ可诱导肿瘤细胞提高MHC分子表达，使残余肿瘤更容易被常规T细胞识别清除。这种免疫协同效应可能使体内CAR-T治疗获得比单独细胞作用更大的效果。另外，有研究在体内CAR载体中融入了免疫调节分子（如IL-12、IL-15等）的表达，以改善肿瘤微环境，从而增强CAR-T功能。这些设计都体现了体内CAR-T可以结合机体原有免疫机制，达到1+1>2的治疗效果。

综上所述，体内CAR-T之所以在某些情况下疗效突出，可能归功于：其产生的CAR-T细胞质地更佳（未过度耗竭、富含记忆亚群）、激活方式更自然（体内逐步扩增、与微环境相互作用）、以及与患者自身免疫系统相辅相成共同对抗肿瘤。这些因素弥补了患者本底T细胞功能不佳的不足，使得即便起始T细胞数量或质量有限，仍能够以小博大地诱发强劲的抗肿瘤免疫反应。

5. 体内 CAR-T 面临的挑战与未来展望

尽管体内CAR-T疗法展现了诸多优点和潜力，但要真正应用于临床、特别是实体瘤治疗，还需克服一系列挑战，并在未来发展中不断完善：

• 特异性递送与安全性：如何确保CAR基因只送达目标T细胞而不误导至其他细胞，是首要挑战之一。若载体将CAR基因整合进了非效应性的免疫细胞（如调节性T细胞)，可能削弱抗肿瘤效果；更严重的是，载体绝不能转导肿瘤细胞本身，否则肿瘤细胞表面表达CAR后会与自身抗原结合，形成“wei装”，逃避免疫识别。文献报道过在传统CAR-T治疗中，有极少数白血病肿瘤细胞意外整合了CAR序列，结果导致该克隆对CAR-T疗法耐受。为此，未来载体设计必须极大提高对T细胞的选择性。目前的解决方案包括：在载体上附加T细胞靶向配体（提高100倍以上的T细胞转导选择性）、采用只能在T细胞内活化的转基因元件（如利用T细胞特异启动子驱动CAR表达），以及区域给药（如肿瘤局部注射以限制作用范围）等。此外，病毒载体（如慢病毒）因为基因组整合可能引发插入突变和肿瘤发生风险。虽然CAR-T细胞体内长期存活需要CAR基因长久表达，但如何在持久疗效和基因安全之间取得平衡是重要课题。一种设想是在载体中加入安全开关基因，如zi杀开关（iCasp9等）或者药物调控开关，一旦CAR-T引发严重不良反应，可通过给药触发CAR-T的凋亡或功能抑制。总之，未来需要更精巧的基因工程手段来提升递送特异性并添加安全保险，保障体内CAR-T疗法的可控性。

• 转导效率与剂量控制：在人体内有效地产生足够数量的CAR-T细胞是另一挑战。相较于小鼠模型，人类患者的T细胞数量庞大且分布于血液和组织各处，载体需要足够剂量和广泛分布才能转导到足够数量的T细胞。病毒载体如AAV在人体的剂量可能受限于免疫反应（患者可能已有抗AAV中和抗体，且重复给药会诱导强免疫反应）；非病毒载体如LNP大剂量时又可能引起一过性的肝脏毒性或炎症反应。因此，如何优化给药剂量和途径以实现高效转导但又不引发毒副作用，需要深入研究。例如，可以探索分次多次给药策略：非整合载体允许重复注射，从而逐步累积CAR-T细胞数量，同时还能根据患者反应动态调整剂量。反之，如果使用整合型载体一次给药就取得高转导效率，则需严格控制剂量以免一次产生过多CAR-T导致严重的CRS等反应。未来的方向可能是在体内实时监测CAR-T细胞的产生和增殖（比如通过标记或成像技术），并据此调节后续剂量，达到精细化给药。

• 肿瘤微环境的抑制因素：实体瘤的免疫抑制微环境仍然是CAR-T疗法难以逾越的障碍。体内产生的CAR-T虽然就地作战，但同样会受到肿瘤微环境（TME）中的抑制信号影响，如肿瘤细胞和基质细胞分泌的TGF-β、IL-10，表达的PD-L1、IDO酶等。这些机制可能使CAR-T功能衰减或耗竭。为此，未来需要在体内CAR-T策略中融入克服TME抑制的设计。例如，使用载体共递送阻断免疫检查点的分子（如小干扰RNA抑制PD-1/CTLA-4）或者促炎性细胞因子基因（如IL-12）来改造微环境。也可以考虑将CAR设计升级，如加入能感应肿瘤酸性或低氧环境的元件，使CAR-T在恶劣环境中仍可高效杀伤。另一方向是联合疗法：体内CAR-T可以与其他药物联用，如检查点抑制剂、肿瘤坏死因子等，产生协同作用。另外，正如已有研究开始探索的，体内CAR-M和CAR-NK细胞疗法可作为CAR-T的补充或替代，在肿瘤内发挥不同机制的抗肿瘤作用。例如，CAR修饰的巨噬细胞能够克服实体瘤致密基质深入肿瘤，并启动炎症反应；CAR-NK细胞无需抗原提呈即可快速杀伤肿瘤。未来的实体瘤免疫治疗可能是多种体内CAR细胞联合，从多角度攻克肿瘤免疫逃逸。

• 患者个体差异：某些患者（尤其是经过多线治疗的晚期肿瘤患者）外周T细胞数量极低或功能严重耗竭，这种情况下体内CAR-T疗法的效果会受限。如果患者体内几乎无可用的T细胞，“巧妇难为无米之炊”。对此，可以在治疗前评估患者的免疫状况，必要时通过细胞因子（如IL-7、IL-15）提升T细胞水平，或输注少量过继的T细胞来“播种”，然后再进行体内CAR-T基因递送。另外，患者已有的抗载体免疫（如抗病毒载体中和抗体、或抗纳米颗粒成分的抗体）也可能降低转导效率。个性化地选择合适的载体类型、或者进行短期免疫抑制（如使用皮质激素或抗CD20清除抗载体抗体）可能成为必要的辅助措施。

• 生产及监管：体内CAR-T疗法兼具基因治疗和免疫细胞治疗的属性，因此在监管审批上需要考虑基因制剂的质量控制和生物安全。生产方面，大规模制备高纯度、高效价的病毒载体仍具挑战；而纳米颗粒mRNA制剂虽然生产工艺成熟（得益于mRNA疫苗经验），但需要严格的稳定性和批间一致性控制。监管层面对这类新兴疗法的安全性审查标准也在探索中，例如需评估长效表达载体的远期风险。未来的发展方向包括：改进载体生产工艺以降低成本（例如使用更高效的细胞工厂产毒系统，或无细胞合成mRNA的大规模流程），建立可靠的质控方法来检测载体的活性和纯度，以及制定针对体内CAR-T的临床随访指南（如长期监测患者是否出现载体相关的不良事件）。只有在生产和监管层面做好充分准备，体内CAR-T才能从实验阶段走向大范围临床应用。

展望：体内CAR-T疗法代表着CAR-T技术发展的新高度和新方向。它将复杂的细胞制备过程简化为“一支注射剂”，有潜力让更多患者负担得起并及时用上CAR-T这样的jian端免疫疗法。对于实体瘤这种需要全身性和局部兼顾的难题，体内CAR-T提供了创新的解法。然而，要充分实现其潜力，仍需通过更多临床试验来验证安全性和有效性，不断改进技术以应对上述挑战。未来，我们可能会看到体内CAR-T与其它疗法相结合，形成多模态的癌症免疫治疗方案。随着对肿瘤免疫和基因递送理解的深入，体内CAR-T疗法有望更精确地定向攻击实体瘤，同时将副作用降至zui低。总而言之，体内CAR-T正处于从实验室迈向临床的关键阶段，它有望接过传统CAR-T的接力棒，成为攻克实体肿瘤的新wu器，为患者带来更高的生存获益。