在细胞研究领域，永生化人牙龈成纤维细胞 - hTERT 是一种具有价值的实验模型。通过引入 hTERT 基因，这些细胞能够突破细胞衰老的限制，实现无限增殖，同时保留了牙龈成纤维细胞的正常表型和功能。这使得它们在细胞生物学、组织工程、药物筛选等多个研究方向上有着广泛的应用。接下来，将从技术参数的角度深入解析这一细胞系的特点与应用。

一、细胞增殖活性检测

（一）MTT 法原理与优化

MTT 法是一种常用的细胞增殖活性检测方法。其原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶可将 MTT 还原为不溶性的蓝紫色结晶 formazan，而死细胞因缺乏这种酶活性无法进行还原反应。通过测定 formazan 在特定波长（570nm）的吸光度值，可间接反映细胞增殖情况。在研究永生化人牙龈成纤维细胞 - hTERT 时，优化实验条件至关重要。例如，细胞接种密度应控制在 5×103 - 1×10? cells/well，以确保细胞在实验期间处于对数生长期。同时，MTT 试剂的浓度和孵育时间也需优化，一般 MTT 试剂浓度为 0.5mg/mL，孵育时间为 4 - 6 小时。

（二）CCK - 8 法的优势与应用

CCK - 8 法与 MTT 法类似，但其底物 WST - 8 在活细胞线粒体中被还原为水溶性的 formazan 染料，无需进行细胞溶解步骤，操作更为简便。其优势在于灵敏度高，尤其适用于低浓度细胞增殖检测。在研究细胞对不同药物的响应时，CCK - 8 法可快速、准确地评估细胞增殖活性变化。例如，在筛选促进牙龈组织修复的药物时，通过 CCK - 8 法检测细胞增殖情况，可快速筛选出潜在的有效药物。

二、细胞周期分析

（一）流式细胞术原理与操作

流式细胞术是一种基于细胞 DNA 含量变化来分析细胞周期分布的技术。通过将细胞固定、渗透处理后，加入 DNA 染料（如 PI 或 7 - ADD），染料可嵌入 DNA 双螺旋结构中，其荧光强度与 DNA 含量成正比。利用流式细胞仪检测每个细胞的荧光信号，经软件分析可得到细胞在 G0/G1、S、G2/M 期的比例分布。在操作过程中，细胞固定是关键步骤之一。常用 70% 乙醇在 - 20℃下固定细胞，固定时间不少于 4 小时，但不宜超过 7 天，以免 DNA 降解影响检测结果。

（二）细胞周期检测的应用场景

在研究细胞周期调控机制时，细胞周期分析是很需要的工具。例如，在探讨不同生长因子对永生化人牙龈成纤维细胞 - hTERT 增殖的影响时，通过流式细胞术分析细胞周期分布，可了解生长因子如何影响细胞周期进程。若某一生长因子使细胞在 S 期的比例显著增加，表明该因子可能促进了细胞 DNA 合成，进而促进细胞增殖。

三、细胞凋亡检测

（一）Annexin V - FITC/PI 双染法原理

Annexin V - FITC/PI 双染法是检测早期凋亡细胞的常用方法。Annexin V 可特异性结合细胞膜磷脂酰丝氨酸（PS），而 PS 在正常细胞中位于膜内侧，细胞凋亡早期会外翻至膜外侧。FITC（异硫氰酸荧光素）标记的 Annexin V 可标记早期凋亡细胞；PI（碘化丙啶）则无法穿透完整细胞膜，仅对晚期凋亡或坏死细胞的核进行染色。通过流式细胞仪检测，可区分活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和坏死细胞。在实验中，细胞染色后应尽快上机检测，一般在 1 小时内完成检测，以避免细胞凋亡进程的进一步发展影响检测结果。

（二）TUNEL 法的应用场景

TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase - mediated dUTP nick end labeling）法是一种检测 DNA 断裂的细胞凋亡原位检测方法。其原理是细胞凋亡时，DNA 双链断裂产生 3' - OH 末端，TUNEL 反应体系中的末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）可将生物素或荧光素标记的 dUTP 连接到这些末端，经荧光显微镜或流式细胞仪检测可定位凋亡细胞。TUNEL 法适用于研究细胞在受到物理、化学损伤后的凋亡情况，尤其在细胞贴壁培养状态下，可直观观察细胞形态与凋亡信号的关系。例如，在研究药物对细胞的毒性作用时，TUNEL 法可直观显示细胞凋亡的形态学变化。

四、细胞表型与功能分析

（一）细胞表型标志物检测

免疫荧光染色法

免疫荧光染色法利用荧光标记的抗体特异性识别细胞内的蛋白质抗原，通过荧光显微镜观察其表达和定位。对于永生化人牙龈成纤维细胞 - hTERT，常用标志物包括波形蛋白（Vimentin）、纤维连接蛋白（Fibronectin）等。例如，波形蛋白是中间丝蛋白，在成纤维细胞中高度表达。通过免疫荧光染色可直观观察其在细胞内的分布情况，评估细胞的成纤维细胞表型维持程度。在实验操作中，需注意抗体的选择与验证，确保其特异性和灵敏度符合要求。

Western blot 分析

Western blot 是一种用于检测蛋白质表达水平的经典方法。通过 SDS - PAGE 电泳分离蛋白质，转膜后用特异性抗体进行杂交，显色后可通过凝胶成像系统定量分析目标蛋白的表达量。对于永生化人牙龈成纤维细胞 - hTERT，Western blot 可精确检测表型相关蛋白的表达变化。例如，在研究细胞在不同培养条件下的表型稳定性时，通过 Western blot 检测波形蛋白、纤维连接蛋白的表达量，可深入探究培养条件对细胞表型的影响。

（二）细胞外基质合成与降解分析

糖胺聚糖（GAG）含量测定

糖胺聚糖是细胞外基质的重要组成部分，其含量可反映细胞的合成代谢活性。常用的方法是 Blyscan 硫酸糖胺聚糖比色测定试剂盒，其原理是利用 1,9 - 二甲基亚甲基蓝与硫酸糖胺聚糖特异性结合，产生蓝色复合物，在 656nm 波长处有特征吸收峰。通过测定吸光度值并与标准曲线对比，可定量分析细胞培养上清或组织匀浆中 GAG 含量。在研究细胞对不同刺激的响应时，GAG 含量测定可评估细胞的基质合成能力。例如，在研究生长因子对细胞外基质合成的促进作用时，通过 GAG 含量测定可量化评估其效果。

基质金属蛋白酶（MMPs）活性检测

基质金属蛋白酶是一类能够降解细胞外基质的酶，在组织重塑和疾病过程中发挥重要作用。采用明胶酶谱法（Zymography）可检测 MMPs 活性。将细胞培养上清与含有明胶的 SDS - PAGE 凝胶进行电泳，MMPs 在凝胶中水解明胶形成透明带，通过凝胶成像系统分析透明带位置和大小，可初步判断 MMPs 的类型和活性。若需精确测定 MMPs 活性，可使用荧光标记的底物法，根据荧光强度变化计算酶活性单位。在研究细胞在炎症环境下的基质降解情况时，MMPs 活性检测可揭示细胞外基质降解机制。

五、细胞信号通路分析

（一）hTERT 信号通路关键蛋白检测

免疫共沉淀技术

免疫共沉淀技术可用于检测 hTERT 信号通路中蛋白质之间的相互作用。例如，研究 hTERT 与细胞周期相关蛋白（如 p16、p53）的结合情况时，先用抗 p53 抗体孵育细胞裂解液，使 p53 蛋白与抗体结合形成免疫复合物，通过蛋白 A/G 琼脂糖凝胶捕获复合物，经洗涤后用抗 hTERT 抗体进行 Western blot 检测，验证两者相互作用。在实验过程中，需优化抗体浓度、孵育时间和洗涤条件，以提高免疫共沉淀的特异性和效率。

酶联免疫吸附测定（ELISA）

Ras 活性检测 ELISA 试剂盒是一种快速、简便的检测方法。其原理是利用 hTERT 蛋白与下游效应分子的特异性结合，将生物素标记的效应分子固定在微孔板上，加入细胞裂解液后，活化的 hTERT 蛋白与之结合，再通过抗 hTERT 抗体和酶标记二抗进行显色反应，吸光度值与活化 hTERT 蛋白量成正比。该方法适用于高通量筛选实验，可快速评估不同处理条件下 hTERT 信号通路的激活状态。

（二）下游信号通路磷酸化水平分析

Western blot 检测磷酸化蛋白

Western blot 是分析信号通路磷酸化水平的常用方法。以 MAPK 信号通路为例，使用特异性抗磷酸化 ERK1/2 抗体，可检测 ERK1/2 蛋白的磷酸化水平，反映信号通路的激活程度。在实验中，需使用磷酸酶抑制剂处理细胞裂解液，防止磷酸化蛋白在提取过程中去磷酸化。同时，应设置总蛋白抗体作为内参，校正蛋白加载量差异，确保检测结果的准确性。

流式细胞术检测细胞内磷酸化蛋白

流式细胞术也可用于检测细胞内磷酸化蛋白水平。通过固定、透化细胞后，用荧光标记的抗磷酸化蛋白抗体进行染色，利用流式细胞仪检测细胞内荧光信号强度。该方法的优势在于可同时检测细胞表面标志物和内源性磷酸化蛋白，实现细胞分群和信号通路分析的结合。例如，在研究不同细胞亚群对药物刺激的响应时，流式细胞术可提供细胞群体水平的信号通路激活信息。