最初，从患者供体中分离出 PBMC。由于 CAR-T 细胞的最终产量可能会受到起始原材料的影响，因此通过流式细胞术检测记忆 T 细胞、活化 T 细胞和耗竭 T 细胞的比例，为免疫细胞群体的异质性设定了一个基准，并且如果在工程化之前分离 T 细胞，还可以确定样本的总体纯度（图 1，Stage 1）。

图 2 展示了免疫细胞治疗过程（图 1）的 Stage 1 (Day 0)，供体 PBMCs 中表达记忆标志物（CD45RO/CD45RA）、激活标志物（CD69/CD38）和耗竭标志物（TIM-3/LAG-3）的 T 细胞亚群分型。

图 2  采用流式细胞术的多色 T 细胞检测 Panel 对 PBMC 细胞进行 T 细胞记忆、激活和耗尽的表征。冷冻保存的人（第 0 天）PBMCs 复苏后，用三种流式细胞术检测 panel 进行染色，以评估其在 T 细胞激活之前的初始（na?ve）、记忆、耗竭和激活表型。PBMCs 首先用 anti-human CD3 mFluor™ Violet 450、CD4 mFluor™ Violet 500、CD8 Alexa Fluor^® 700 以及 Live/Dead 750/777 viability dye 进行染色，随后用三种不同的检测 Panel 分别评估 T 细胞的 1）记忆（CD45RO Alexa Fluor^® 647、CD45RA mFluor™ Violet 610 和 CCR7 PE），2）耗竭（PD-1 Alexa Fluor^® 647、TIM-3 PE 和 LAG-3 mFluor™ Violet 610），以及 3）激活（CD25 mFluor™ Violet 610、CD69 PE 和 CD38 Alexa Fluor^® 647）。

在 T 细胞激活和细胞培养扩增过程中（图 1，Stage 2），通过流式细胞术进行免疫表型分析，用于评估 T 细胞激活的变化以及 T 细胞亚群分布的总体变化。这些变化对于理解 T 细胞工程的成功与否以及最终产品的产量至关重要。

图 3 展示了免疫细胞治疗过程（图 1）Stage 2：扩增 T 细胞的第 2 天激活表型以及第 9 天的记忆和耗竭表型鉴定。

图 3  采用流式细胞术的多色 T 细胞检测 Panel 对激活的 T 细胞进行 T 细胞记忆、激活和耗尽的表征。人外周血单个核细胞（PBMCs）用生物素标记的 GMP Anti-Human CD3（货号 MAB11411-GMP）和 GMP Anti-Human CD28（货号  MAB11412-GMP）与 M-270 磁珠偶联，并加入 200 IU/mL 的 GMP Recombinant Human IL-2（货号 BT-202-GMP）刺激 9 天。第 9 天扩增的 T 细胞 anti-human CD3 mFluor™ Violet 450、CD4 mFluor™ Violet 500、CD8 Alexa Fluor^® 700 以及 Live/Dead 750/777 viability dye 进行染色，随后用三种不同的检测 Panel 分别评估 T 细胞的 1）记忆（CD45RO Alexa Fluor^® 647、CD45RA mFluor™ Violet 610 和 CCR7 PE），2）耗竭（PD-1 Alexa Fluor^® 647、TIM-3 PE 和 LAG-3 mFluor™ Violet 610），以及 3）激活（CD25 mFluor™ Violet 610、CD69 PE 和 CD38 Alexa Fluor^® 647）。

流式细胞术可检测供体 T 细胞之间的记忆、激活和耗竭标志物的差异。图 4 展示了从第 0 天到第 2 天（用于激活）或第 9 天（用于记忆和耗竭）使用流式细胞术检测 Panel，可以提供关于供体 T 细胞随时间变化的定量数据。

图 4 T 细胞记忆、激活和耗竭检测 Panel 追踪检测 T 细胞群随时间的变化。人 PBMCs 被用生物素标记的 GMP Anti-Human CD3 (货号 MAB11411-GMP) 和 GMP Anti-Human CD28 (货号  MAB11412-GMP) 与 M-270 Dynabeads + 200 IU/mL GMP Recombinant Human IL-2 (货号 BT-202-GMP) 刺激 9 天，如图 4。在激活后，分析了 Day 0（Stage1）和 Day 9（A、B）以及 Day 2（C）的 CD45RO+/CCR7+中央记忆 T 细胞（A）、PD-1+细胞（B）和 CD25+/CD69+细胞（C）的表达差异。