Endothelial Rap1 restricts inflammatory signaling to protect from the progression of atherosclerosis.

Keywords: Cardiovascular disease, Endothelial function, Hemodynamics, Inflammatory signaling, Small GTPase Rap1

动脉粥样硬化作为血管慢性炎症疾病，其病理血管壁重塑源于内皮损伤引发的慢性炎症，且内皮对血流模式的差异反应决定了斑块的几何定位。内皮连接机械传感复合物中的 Rap1 是内皮机械传感反应的关键成分，其缺失会损害 NO 释放和内皮功能。Rap1 的两种亚型 Rap1A 和 Rap1B 在调节整合素和钙黏蛋白等方面发挥重要作用，对血管稳定、生成及内皮屏障调节很重要。分子层面，Rap1 通过调控 VEGFR2 信号等影响内皮功能?；诖?，威斯康星州 Versiti 血液研究所的研究团队对高胆固醇血症小鼠模型中内皮 Rap1B 缺失的影响进行了研究，结果发现其虽不增加血管通透性，却能增强细胞因子受体信号和 NF-κB 激活，揭示了 Rap1 通过限制促炎细胞因子信号维持内皮稳态的新机制。研究成果发表在Arterioscler Thromb Vasc Bio期刊题为“Endothelial Rap1 restricts inflammatory signaling to protect from the progression of atherosclerosis”。

首先，为了研究内皮细胞中 Rap1B缺失对载脂蛋白 E 缺陷（ApoE?/?）小鼠动脉粥样硬化进展的影响，研究将Rap1iΔEC小鼠和对照小鼠分别与ApoE?/?小鼠杂交，生成Athero-Rap1BiΔEC和Athero-对照小鼠，喂食高脂肪西式饮食（HFD，21.2% 脂肪，0.2% 胆固醇 ）16周诱导高胆固醇血症。结果发现，与正常实验室饮食喂养的对照小鼠相比，Athero - 对照小鼠的血清胆固醇升高约 3 倍（图 1A）。Athero-Rap1BiΔEC 小鼠的血清胆固醇也升高，但 Athero-Rap1BiΔEC 与 Athero - 对照小鼠的总胆固醇水平无差异（图 1A）。在 HFD 处理结束时，用油红 O 染色观察动脉粥样硬化病变，并在雄性和雌性小鼠的主动脉正面切片中量化斑块面积（图 1B）。Athero-Rap1BiΔEC  的动脉粥样硬化病变面积显著增加 ，且雌性小鼠病变更明显（图 1C ）。由于基础内皮NO合成对预防动脉粥样硬化进展至关重要，研究进一步给小鼠补充L-精氨酸，发现其能减少Athero-Rap1BiΔEC小鼠的斑块形成（图 1C ）。而在细胞实验中，L-精氨酸处理虽能增加对照和siRap1B人主动脉内皮细胞的NO释放，但siRap1B细胞的NO释放量更低（图 1D），且Rap1B缺陷会增加细胞对NO抑制剂的敏感性（图 1E）。这些数据表明，NO生成缺陷是Athero-Rap1BiΔEC小鼠动脉粥样硬化增强的潜在因素，证实了Rap1B在体内对动脉粥样硬化进展的保护作用。

接下来，为了探究 Rap1 如何影响血流模式剪切应力相关的病理变化，研究人员对降主动脉（层流区域）和主动脉弓（紊乱血流区域）的斑块进行量化分析。结果显示，高脂饮食 16 周后，主动脉弓的动脉粥样硬化斑块积聚在升主动脉（AA）和降主动脉（DA）内曲率的 5 个区域，以及头臂动脉（BCA）、左颈总动脉（LCC）和左锁骨下动脉（LS）分支分叉的对侧表面（图 1F）。 与 Athero - 对照小鼠相比， Athero-Rap1BiΔEC 小鼠降主动脉（层流区）的病变面积显著增加，而补充 L - 精氨酸可使其斑块面积降至对照水平（图 1G ）。在紊乱血流的主动脉弓区域，两者斑块面积无显著差异，但 Athero-Rap1BiΔEC 小鼠在层流和紊乱流区域的平均斑块体积均显著增加（图 1H） 。进一步研究发现，Athero-Rap1BiΔEC 小鼠主动脉根部的巨噬细胞密度显著升高（图 1J） ，表明炎症反应增强。这些结果表明，内皮 Rap1B 通过不同机制在层流和紊乱血流区域发挥抗动脉粥样硬化作用。

图1    无论是否存在层流，内皮 Rap1B 缺失均会加剧动脉粥样硬化斑块沉积。

为了验证 Rap1 缺失的内皮细胞中炎症性 CAM 表达升高可能与白细胞募集增加相关假设，研究人员对 Athero - 对照和 Athero-Rap1iΔEC 小鼠主动脉弓切片进行荧光染色，原位检测炎症性 CAM 的表达（图 2A，B）。结果发现 Athero-Rap1iΔEC 小鼠主动脉弓中 VCAM1 和 ICAM1 的表达较对照小鼠显著增加（图 2C，D），而基础条件下 EC-Rap1 缺失并未引起 CAM 表达增加，Rap1iΔEC 和对照小鼠的 VCAM1 水平相似，且两种小鼠中均未检测到 ICAM1。此外，在细胞实验中，TNF-α 处理 48 小时后，Rap1 缺失的 hAECs 中 VCAM1 表达明显升高（图 2E，F）。这些结果表明，内皮 Rap1 缺失会增强血管内皮对 TNF-α 的致动脉粥样硬化反应，在促炎信号诱导的内皮 CAM 表达中发挥关键作用。TNF-α 除了通过诱导促炎转录发挥致动脉粥样硬化作用外，还能通过引起血管屏障功能障碍的非转录机制发挥作用。为了探究体内 Rap1 缺失的内皮细胞屏障通透性增加的生理意义，研究人员检测了 Athero - 对照和 Athero-Rap1BiΔEC 小鼠主动脉根部中BSA的外渗情况，发现在动脉粥样硬化条件下两者血管通透性无差异，脂多糖处理诱导急性炎症时结果也相似。这些结果表明，Rap1 缺失会增加细胞黏附分子的转录，但不会增加血管通透性。

图2    在缺乏层流的情况下，内皮细胞 Rap1 缺失会升高炎症受体（CAM）的表达。

接着，研究人员检测了主动脉弓中 NF-κB 的激活情况（图 3A）。结果发现 Athero-Rap1iΔEC 小鼠主动脉弓内皮细胞中 NF-κB 的 p65 亚基核定位较 Athero - 对照小鼠显著增加（图 3B），表明其血管中 NF-κB 激活增强。在紊乱血流区域，NF-κB 和促炎蛋白转录的增加由 TNF-α 受体 TNFR1 介导，而 Athero-Rap1iΔEC 主动脉中 CAM 表达升高（图 2C,D） 和 NF-κB 激活（图 3B） 提示 Rap1 可能调控 TNF-α 诱导的激活过程。为了验证这一假设，研究人员通过在缺乏层流的条件下研究了 TNF-α 对内皮细胞中 NF-κB 激活早期信号事件的影响 。在此条件下，TNF-α 刺激 hAECs 可导致 IκB 激酶（IKK）快速磷酸化，其下游的 IκB 在 Ser32/36 位点磷酸化，随后 IκB 降解（图 3C）。当 hAECs 缺失 Rap1 时，TNF-α 诱导的 IκB 磷酸化在刺激后2 分钟即迅速升高（图 3D）。  因此，siRap1 hAECs 中总 IκB 的变化呈瞬时性，与磷酸化依赖的 IκB 降解加速一致（图 3C）。 与 Rap1 缺失下 IκB 磷酸化增强一致，TNF-α 诱导的 IKK 磷酸化在 Rap1 缺失的 hAECs 中较野生型对照显著升高（图 3D）。 综上，Rap1 缺失可显著增强 IKK 激活，加速 NF-κB 激活的早期信号事件。

图3   在缺乏层流的情况下，Rap1 缺失会导致 NF-κB 激活增加。

TNFR 复合体的信号传导可通过募集 PI3K 及其靶标 Akt 来增强，作为 TNFR 复合体的一部分，Akt 可磷酸化 IκB 和 IKK 以诱导 NF-κB 活性。先前研究表明 Rap1 参与上游 Akt 激活因子 PI3K 的调控，其可通过效应结构域与 PI3K 相互作用，通过构象改变和 PI3K 重定位促进 PI3K 激活?；诖?，研究假设 Rap1 缺失时 PI3K-Akt 相互作用可能被干扰，导致 NF-κB 激活增加。

为了验证上述假设，研究人员在 Rap1 缺陷和对照 ECs 中，使用 Akt1/2 选择性抑制剂 AKT inhibitor VIII 处理后检测 TNF-α 诱导的 IKK 和 IκB 磷酸化（图 4A）。结果显示 TNF-α 处理未导致 Akt 磷酸化升高，而 AKT inhibitor VIII 处理使 WT 和 siRap1 ECs 中 Akt-Ser473 磷酸化显著降低（图 4B），且该抑制剂不改变 WT hAECs 中 IκB 或 IKK 的磷酸化，却能降低 siRap1 hAECs 中 TNF-α 诱导的过度 IκB 和 IKK 磷酸化至 WT 水平（图 4C,D）。这些结果表明，限制 Rap1 缺陷细胞中的 Akt 活性可恢复 ECs 对 TNF-α 的正常反应，提示 Rap1 通过限制 Akt 介导的 IKK 激活来抑制 TNF-α 诱导的 NF-κB 激活信号。

图4    在缺乏层流的情况下，Rap1 通过抑制 Akt 来限制向 NF-κB 的炎症信号传导。

图5    内皮 Rap1 通过不同的机制在存在和缺乏层流的情况下预防动脉粥样硬化。

总之，该研究确定了 EC 稳态的新机制，内皮 Rap1 在存在和缺乏层流的情况下均可抑制动脉粥样硬化进展：在层流中，Rap1 刺激 NO 释放起主要作用；在缺乏层流时，限制促炎信号传导起主要作用。Rap1 抗动脉粥样硬化功能（图5）为内皮稳态和 CVD 进展的机制提供了新的见解。

参考文献：Singh B, Kosuru R, Lakshmikanthan S, Sorci-Thomas MG, Zhang DX, Sparapani R, Vasquez-Vivar J, Chrzanowska M. Endothelial Rap1 (Ras-Association Proximate 1) Restricts Inflammatory Signaling to Protect From the Progression of Atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2021 Feb;41(2):638-650. doi: 10.1161/ATVBAHA.120.315401. Epub 2020 Dec 3. PMID: 33267664; PMCID: PMC8105264.

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