一、背景

人膜间皮细胞是用pRSV-T质粒(含有SV40早期区域和劳斯肉瘤病毒长末端重复序列的SV40 ori构建体)转染细胞并克隆。间皮细胞从非癌个体获得的胸膜液中分离。

二、人膜间皮细胞培养操作规程

1、人膜间皮细胞培养基及培养冻存条件准备：

1）准备Medium 199培养基(添加NaHCO3 1.5g/L,3.3 nM EGF，400 nM氢化可的松，870 nM牛胰岛素，20 mM HEPES，3.87µg/L H2SeO3)，90%；优质胎牛血清，10%。

2）人膜间皮细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。

3）人膜间皮细胞冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。液氮储存。

2、人膜间皮细胞处理：

1）复苏人膜间皮细胞：将含有1mL人膜间皮细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于冻存管盖部）摇晃解冻，移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养基后吹匀。然后将所有人膜间皮细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查人膜间皮细胞密度。

2）人膜间皮细胞传代：如果人膜间皮细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁人膜间皮细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗人膜间皮细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若人膜间皮细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3ml此细胞的培养基终止消化。

3.轻轻吹打后吸出，移入15ml离心管中，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养液后吹匀。

4.移入到事先准备好的含有5ml培养基的T-25培养瓶中或含有14ml培养基的T-75培养瓶中培养。

3）人膜间皮细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，先要消化处理并进行细胞计数。消化方法按照细胞传代方法的1-3步骤进行，最后的重悬液使用血清。悬浮人膜间皮细胞直接计数后离心，用血清重悬浮，加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀，按每1ml的数量分配到冻存管中。

三、应用

人膜间皮细胞可以用于苦参碱抑制TGF-β1诱导的人腹膜间皮细胞上皮间充质转分化机制的研究：

通过探索苦参碱对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的人腹膜间皮细胞EMT的影响,为防治腹膜纤维化药物的研发提供科学依据。

方法：采用5ng/ml的TGF-β1诱导人腹膜间皮细胞使其发生EMT,同时给予不同浓度的苦参碱(0.4、0.6、0.8和1.0mg/ml)进行干预处理,然后分别采用实时荧光定量PCR和免疫蛋白印迹(western blotting,WB)检测EMT相关基因(E-cadherin、α-SMA、ColⅢ和Fibronectin)的mRNA和蛋白的表达水平,根据实时荧光定量PCR和WB结果分析苦参碱对人腹膜间皮细胞EMT是否存在抑制作用。

如果苦参碱对TGF-β1诱导人腹膜间皮细胞EMT存在显著的抑制作用,则选取苦参碱抑制人腹膜间皮细胞EMT的浓度,然后再使用5ng/ml的TGF-β1诱导人腹膜间皮细胞使其发生EMT,同时采用浓度的苦参碱干预处理人腹膜间皮细胞,收集细胞提取总RNA,逆转录后进行RNA-seq测序分析其全基因组的mRNA的表达水平并筛选表达差异显著的基因,再利用这些基因进行KEGG Pathway分析其主要富集的信号通路,初步探索苦参碱抑制人腹膜间皮细胞EMT的具体分子机制,最后通过实时荧光定量PCR和WB进行验证。

结果：(1)5ng/ml的TGF-β1刺激能上调人腹膜间皮细胞α-SMA、ColⅢ和Fibronectin的mRNA和蛋白表达水平,下调E-cadherin的mRNA和蛋白表达水平;不同浓度的苦参碱(0.4、0.6、0.8和1.0mg/ml)干预处理后均能下调α-SMA、ColⅢ和Fibronectin的mRNA和蛋白表达水平,上调E-cadherin的mRNA和蛋白表达水平,其中0.8和1.0 mg/ml的苦参碱的干预。

(2)RNA-seq测序的结果显示,以q Value<0.05且差异倍数|Fold Change|>2为筛选条件,韦恩图取各处理组表达差异显著的基因之间的交集,筛选获得154个表达差异显著的基因与苦参碱抑制TGF-β1诱导的人腹膜间皮细胞EMT相关;进一步通过KEGG通路分析这154个基因发现其主要富集在MAPK等信号通路上;另外,在这154个表达差异显著的基因中发现TGF-β1激活的Smad依赖和非Smad依赖信号通路的共同下游因子Snail2表达差异显著。

(3)WB检测MAPK信号通路中的关键蛋白ERK1/2的磷酸化水平,结果显示TGF-β1能显著上调ERK1/2磷酸化蛋白的表达水平,而苦参碱干预处理后能使其水平下调。结论:苦参碱通过ERK1/2 MAPK信号通路下调Snail2基因的表达水平来抑制TGF-β1诱导的人腹膜间皮细胞EMT。

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