在生物体内，氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时，体内活性氧（ROS）产生过多或抗氧化防御系统功能减弱，导致氧化与抗氧化失衡的一种状态。抗氧化活性物质能够清除 ROS，减轻氧化应激对细胞和组织的损伤。非酶法抗氧化活性检测是评估生物样本（如植物提取物、食品、血液等）中非酶类抗氧化物质总活性或特定成分抗氧化能力的重要手段，在食品科学、医药研发、生物化学等领域应用广泛。

一、非酶法抗氧化活性检测的重要性

非酶类抗氧化物质是机体抗氧化防御系统的重要组成部分，包括维生素（如维生素 C、维生素 E）、多酚类化合物（如黄酮类、酚酸类）、类胡萝卜素、谷胱甘肽（非酶促状态下）等。这些物质通过直接清除自由基、螯合金属离子、抑制氧化酶活性等方式发挥抗氧化作用。与酶法抗氧化系统（如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶等）相比，非酶类抗氧化物质的来源更广泛，不仅存在于生物体内，还大量存在于植物、食品等天然产物中。

非酶法抗氧化活性检测能够综合评估样本中所有非酶抗氧化物质的总抗氧化能力，或针对特定类型的抗氧化物质进行活性测定，为筛选天然抗氧化剂、研究抗氧化机制、评估食品营养价值、开发抗氧化药物等提供重要依据。

二、常见非酶法抗氧化活性检测方法

总抗氧化能力（TAC）检测法

总抗氧化能力检测法是评估样本中所有抗氧化物质协同作用的综合指标，常用的方法包括：

• 铁离子还原抗氧化能力法（FRAP 法）

原理：在酸性条件下，样本中的抗氧化物质能将三价铁离子（Fe3?）还原为二价铁离子（Fe2?），Fe2?与三吡啶三吖嗪（TPTZ）结合形成蓝紫色复合物，在 593nm 处有最大吸收峰。通过测定吸光度的变化，可计算样本的抗氧化活性，吸光度越大，抗氧化能力越强。

操作要点：反应体系通常为 pH3.6 的醋酸缓冲液、10mmol/L TPTZ 溶液和 20mmol/L FeCl?溶液按 10:1:1 混合，加入样本后 37℃孵育一定时间，测定吸光度。该方法操作简便、快速，适用于大量样本的筛查，但受反应时间和温度影响较大。

适用范围：适用于植物提取物、食品、血清等样本的总抗氧化能力测定。

• 2,2'- 联氮 - 双 - 3 - 乙基苯并噻唑啉 - 6 - 磺酸（ABTS）法

原理：ABTS 在过氧化物和金属离子作用下生成稳定的蓝绿色阳离子自由基（ABTS??），样本中的抗氧化物质可清除 ABTS??，使溶液颜色变浅，在 734nm 处的吸光度降低。通过吸光度的变化计算抗氧化活性，吸光度降低越多，抗氧化能力越强。

操作要点：先制备 ABTS??工作液，将 ABTS 溶液与过硫酸钾溶液混合，室温避光孵育 12-16 小时，使用前用磷酸盐缓冲液稀释至吸光度为 0.70±0.02。加入样本后反应一定时间，测定吸光度。该方法灵敏度高，可在水相和有机相中进行，适用于多种类型的样本。

适用范围：广泛应用于食品、药物、植物提取物等的总抗氧化能力检测。

• 1,1 - 二苯基 - 2 - 三硝基苯肼（DPPH）法

原理：DPPH 是一种稳定的自由基，在 517nm 处有强吸收，呈紫色。当样本中存在抗氧化物质时，DPPH 自由基被清除，溶液颜色变浅，吸光度降低。通过吸光度的变化计算自由基清除率，清除率越高，抗氧化活性越强。

操作要点：将 DPPH 乙醇溶液与样本混合，室温避光反应 30 分钟后，测定 517nm 处的吸光度。该方法操作简单、快速，成本低，但受溶剂极性影响较大，对脂溶性抗氧化物质的检测效果较好。

适用范围：常用于植物提取物、食品、化妆品等的抗氧化活性初步筛选。

基于自由基清除的特异性检测法

除了总抗氧化能力检测，还有针对特定自由基的清除能力检测方法，以评估样本对不同类型 ROS 的清除效果：

• 超氧阴离子自由基（O???）清除法

原理：通过黄嘌呤 - 黄嘌呤氧化酶体系产生 O???，O???可还原氮蓝四唑（NBT）生成蓝色甲臜，样本中的抗氧化物质清除 O???后，甲臜生成量减少，在 560nm 处的吸光度降低。

操作要点：反应体系包括黄嘌呤、黄嘌呤氧化酶、NBT 和样本，37℃孵育一定时间后测定吸光度。该方法特异性较高，可反映样本对 O???的清除能力。

适用范围：适用于研究样本在生物体内的抗氧化机制，尤其是与炎症、衰老相关的氧化应激过程。

• 羟基自由基（?OH）清除法

原理：通过 Fe2?与 H?O?反应（Fenton 反应）产生?OH，?OH 可氧化脱氧核糖生成丙二醛等产物，TBA反应生成红色复合物，在 532nm 处有吸收峰。样本中的抗氧化物质清除?OH 后，红色复合物生成量减少，吸光度降低。

操作要点：反应体系含 FeSO?、H?O?、脱氧核糖、TBA 和样本，37℃孵育后沸水浴加热，冷却后测定吸光度。该方法可特异性检测样本对?OH 的清除能力，?OH 是活性*强的 ROS 之一，对细胞损伤较大，因此该方法具有重要的生物学意义。

金属离子螯合能力检测法

许多氧化反应依赖金属离子（如 Fe2?、Cu2?）的催化，抗氧化物质通过螯合这些金属离子，可抑制氧化反应的发生。常用的方法是亚铁离子螯合能力检测法：

原理：样本中的抗氧化物质与 Fe2?结合，形成稳定的螯合物，从而抑制 Fe2?与菲啰嗪的反应。菲啰嗪与 Fe2?结合生成红色复合物，在 562nm 处有吸收峰，螯合能力越强，红色复合物生成越少，吸光度越低。

操作要点：将样本与 FeSO?溶液混合，孵育后加入菲啰嗪，测定吸光度。该方法适用于评估样本中具有金属螯合能力的抗氧化物质（如多酚类、氨基酸等）的活性。

脂质过氧化抑制法

脂质过氧化是指多不饱和脂肪酸在 ROS 作用下发生氧化分解的过程，会产生丙二醛等有害物质。通过检测样本对脂质过氧化的抑制能力，可评估其抗氧化活性：

原理：以亚油酸或大鼠肝匀浆等为脂质体系，在氧化条件下（如 Fe2?催化）发生脂质过氧化，产生的丙二醛与 TBA 反应生成红色复合物，样本中的抗氧化物质可抑制脂质过氧化，使红色复合物生成量减少。

操作要点：将样本与脂质体系、Fe2?溶液混合，孵育一定时间后加入 TBA，沸水浴加热，测定 532nm 处的吸光度。该方法模拟了生物体内脂质的氧化过程，更接近生理条件，适用于研究样本对生物膜氧化损伤的?；ぷ饔?。