一、背景

人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離液用于人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離，主要用于人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)等研究。目前常用的分離hMSCs的方法主要有全骨髓法和密度梯度離心法，全骨髓法即根據(jù)干細(xì)胞在低血清培養(yǎng)基中有貼壁優(yōu)勢(shì)特性，定期換液除去不貼壁細(xì)胞，從而達(dá)到純化及擴(kuò)增MSC的目的。密度梯度離心法即根據(jù)骨髓中各細(xì)胞成分比重的不同，分離單核細(xì)胞進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。二者本質(zhì)上無(wú)多大區(qū)別。隨著對(duì)MSC表面抗原認(rèn)識(shí)的深入，又有人利用免疫方法如流式細(xì)胞儀法、免疫磁珠法等對(duì)其進(jìn)行分離純化。但經(jīng)過(guò)流式或磁珠分選后的細(xì)胞出現(xiàn)了增殖緩慢等一些問(wèn)題，加之成本較高和技術(shù)的難度，在某種程度上限制了這些方法的廣泛應(yīng)用。

人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法：

(1)無(wú)菌條件下抽取骨髓液5mL，用等體積PBS稀釋混勻，室溫下1500rpm離心10分鐘；

(2)棄去脂肪層，將稀釋骨髓液沿離心管壁緩慢加到等體積Ficoll分離液（1.077g/mL）上面，室溫2500rpm離心30分鐘；

(3)吸取界面白膜狀層的單個(gè)核細(xì)胞，用PBS混懸后，室溫1500rpm離心10分鐘；

(4)棄上清并重復(fù)洗滌2次。

(5)用含10%FBS的LG—DMEM培養(yǎng)液（或骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞專用培養(yǎng)基）重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2x105/mL，接種于底面積為25cm2培養(yǎng)瓶中置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；

(6)于3天后換液，棄去懸浮細(xì)胞后，每2-3天換液一次；

(7)每日鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)變化，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80%-90%融合時(shí)，用胰蛋白酶-EDTA溶液（0.25%:0.02%）進(jìn)行消化，按1：2比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

二、應(yīng)用

用于人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定研究：

建立人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells,MSCs）體外分離、培養(yǎng)及擴(kuò)增的方法,觀察MSCs體外培養(yǎng)增殖的生物學(xué)特性,并應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù),檢測(cè)細(xì)胞表型,分析鑒定MSCs的純度。

方法：

（1）無(wú)菌條件下抽取骨髓液5mL,用等體積PBS稀釋混勻,室溫下1500rpm離心10分鐘,棄去脂肪層,將稀釋骨髓液沿離心管壁緩慢加到等體積Ficoll分離液（1.077g/mL）上面,室溫2500rpm離心30分鐘,吸取界面白膜狀層的單個(gè)核細(xì)胞。用PBS混懸后,室溫1500rpm離心10分鐘,棄上清并重復(fù)洗滌2次。用含10%FBS的LG—DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為2x105/mL,接種于底面積為25cm2培養(yǎng)瓶中置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。3天后換液,棄去懸浮細(xì)胞后,每2-3天換液一次。每日鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)變化,待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80%-90%融合時(shí),用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA（1:1,V/V）進(jìn)行消化,再按1：2比例進(jìn)行傳代培養(yǎng),共傳代三次。

（2）MSCs的生長(zhǎng)曲線測(cè)定：取P3細(xì)胞,按5×104/mL濃度接種于24孔培養(yǎng)板培養(yǎng),每天取3孔,計(jì)算平均值,連續(xù)培養(yǎng)8天,采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法,繪制生長(zhǎng)曲線。

（3）貼壁率測(cè)定：取P3細(xì)胞,按5×104/mL濃度接種于25cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng),每2小時(shí)取2瓶,消化計(jì)數(shù),計(jì)算貼壁率,繪制貼壁率曲線。

（4）MSCs的表型鑒定：取P3細(xì)胞,將細(xì)胞消化吹打制成單細(xì)胞懸液,1500rpm離心5分鐘,棄去上清液,用PBS重復(fù)洗滌后,調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/mL,各取細(xì)胞懸液100μL,分別滴加熒光標(biāo)記抗人CD34-PE、CD44-FITC、CD29-PEcy5.5、CD105-FITC、HLA-DR-PE抗體10μL,4℃避光孵育30分鐘,PBS洗滌后應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè),確定MSCs的表面標(biāo)志物的表達(dá)情況。

結(jié)果：MSCs屬于骨髓中的單個(gè)核細(xì)胞,采用密度梯度離心法與貼壁篩選法相結(jié)合可以有效分離、純化人骨髓MSCs。細(xì)胞形態(tài)觀察：細(xì)胞初接種入培養(yǎng)瓶時(shí)為圓形的單個(gè)核細(xì)胞,大小不一,與周圍的血細(xì)胞相互混雜。

培養(yǎng)24小時(shí)后,細(xì)胞開始出現(xiàn)貼壁,48-72小時(shí)細(xì)胞貼壁逐漸增多,72小時(shí)換液后,可見少量分散的短梭形及不規(guī)則多角形的初始貼壁細(xì)胞。第4-8天細(xì)胞生長(zhǎng)快,呈集落樣生長(zhǎng),可見有粗大的突起伸出,細(xì)胞形態(tài)呈梭形。第10-12天后細(xì)胞克隆進(jìn)一步擴(kuò)大,呈大的長(zhǎng)梭形,培養(yǎng)至第14-16天時(shí)貼壁細(xì)胞可達(dá)80%～90%融合,大量貼壁細(xì)胞呈長(zhǎng)梭狀成纖維細(xì)胞樣形態(tài)并列或呈漩渦狀排列。

傳代細(xì)胞剛接種時(shí)為圓形,較大,24小時(shí)內(nèi)能貼壁,伸展呈梭形,增殖迅速,5-7天細(xì)胞融合可達(dá)90%。細(xì)胞形態(tài)均勻,與成纖維細(xì)胞形態(tài)相似,大部分呈長(zhǎng)梭狀,排列規(guī)則。

北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司的微生物菌種查詢網(wǎng)提供微生物菌種保藏、測(cè)序、購(gòu)買等服務(wù),是中國(guó)微生物菌種保藏中心的服務(wù)平臺(tái)，并且是集微生物菌種、菌種,ATCC菌種、細(xì)胞、培養(yǎng)基為一體的大型微生物查詢類網(wǎng)站，自設(shè)設(shè)備及技術(shù)的微生物菌種保藏中心！歡迎廣大客戶來(lái)詢！