在分子生物学研究中，双荧光素酶报告基因检测实验因其高灵敏度、操作便捷和结果可靠，被广泛应用于启动子活性分析、miRNA靶基因验证、转录因子功能研究等领域。然而，实验过程中常常会遇到各种问题，例如荧光值异常、重复性差等，这些问题可能会影响实验结果的准确性。为了帮助大家更好地掌握这一技术，我们整理了双荧光素酶报告基因检测实验中的常见问题与解答，涵盖了实验设计、操作细节、数据分析等多个方面，希望这些内容助您轻松搞定实验！

Q1:双荧光素酶报告基因实验可应用于哪些研究方向？

A1:①验证microRNA同mRNA靶向互作；②验证microRNA同lncRNA/circRNA靶向互作；③验证转录因子与启动子互作；④启动子结构分析⑤启动子SNP分析

Q2:如何选择报告基因载体？

A2:萤火虫荧光素酶基因和海肾基因（内参）在同一个载体上，选择pmirGLO等载体；萤火虫荧光素酶基因和海肾基因（内参）分别在一个载体上，可选择pGL3/pRL系列载体；载体详细信息可参考【干货分享】手把手教你做双荧光素酶实验。

Q3:如何选择主报告基因和内参基因的质粒比例？

A3:通常，主报告基因质粒与内参质粒的比例，建议作一个预实验来调整（如萤火虫载体与海肾载体比例分别用1：10、1：20、1：50、1：100），确保内参基因被准确检测且不干扰主报告基因的表达。

Q4:如何保证检测数据的有效性和真实性？

A4:①设立对照和重复：实验中应设立阳性和阴性对照，以验证实验系统的有效性且需要做3个或3个以上复孔，并且引入另一个报告基因作为内参，主要是同批次样品检测值也可能出现浮动，排除多种干扰因素的影响（细胞状态、转染效率、载体质量、裂解速度、加样精准度等）。②荧光值控制：荧光值过高可能会超出仪器的检测范围，导致无法检测到值，一般建议将荧光值控制在5-6位之间。

Q5:荧光值过高或过低怎么办？

A5:荧光值过高：可减少质粒转染量，或对裂解产物进行稀释后检测;荧光值过低：可能是转染效率低或裂解不充分，建议优化转染条件、增加细胞量或延长裂解时间。

Q6:复孔间重复性差如何解决？

A6:确保样本均一性，裂解后离心取上清检测；定期校准移液器，保证加样准确性；转染时混合的力度/细胞量/时间等保持一致（同个数量级内的差异是可以接受的）。

Q7:双荧光素酶检测需要使用什么检测板？

A7:建议使用全白板，优势是灵敏度最高而且孔间相互干扰最小。

Q8:双荧光素酶检测需要使用什么仪器？

A8: 化学发光仪或带化学发光检测?？榈拿副暌?。

Q9:海肾和萤火虫是在同一个孔里面检测吗？能否分开检测？

A9:同一个孔里检测，不会相互影响，兰博利德的海肾荧光素酶底物中有淬灭萤火虫荧光值的物质?？梢苑挚觳猓窃谝桓隹桌锛觳饣岣幼既?。

Q10:实验过程有哪些注意事项？

A10:①样品混匀：保证裂解产物与底物快速混合、混合时间一致，避免荧光素酶衰变的影响。②细胞裂解产物处理：细胞裂解产物常温不超过6小时；-20℃一个月；-80℃半年。    ③反应体系：双荧光素酶反应体系：20?μl（细胞裂解产物）、100?μl（萤火虫荧光素酶底物）、100?μl（海肾荧光素酶底物），底物量可根据实际情况调整，但一定要保证底物过量，不然会造成检测结果出现大的偏差。

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