Roles of KLF4 and AMPK in the inhibition of glycolysis by pulsatile shear stress in endothelial cells

Keywords: AMPK; KLF4; epigenetics; GCKR; glycolysis.

内皮细胞覆盖动脉管腔并直接接触血流，其中动脉直段的脉动切应力（PS）维持内皮稳态，而分叉弯曲处的振荡切应力（OS）会引发内皮功能障碍，表现为糖酵解增强、炎症、增殖及活性氧生成，进而导致动脉粥样硬化。糖酵解作为内皮主要能量来源，其异常与多种疾病相关，尽管已有研究表明切应力通过 KLF2、HIF-1α 等因子调节糖酵解，但不同血流模式下的系统调控机制仍不明确。

KLF4 和 AMPK 是内皮机械转导的关键分子：KLF4 作为先锋转录因子，在 PS 作用下可激活抗动脉粥样硬化基因并重塑染色质；AMPK 作为代谢调控因子，通过磷酸化靶蛋白调节能量稳态。糖酵解限速酶 HK1 可被 GCKR 结合抑制，而 GCKR 的表达和修饰动态调控糖酵解速率。

鉴于此，研究团队对 KLF4 和 AMPK 在通过 GCKR 调节 EC 糖酵解中的作用进行调查，并在高运动量小鼠的血管健康中进行验证。发现 PS 可通过 KLF4 介导的表观遗传和转录调控上调 GCKR 表达，并通过 AMPK 磷酸化 GCKR 增强其与 HK1 的结合，从而抑制糖酵解。研究成果发表于PNAS 期刊题为“Roles of KLF4 and AMPK in the inhibition of glycolysis by pulsatile shear stress in endothelial cells”。

首先，研究团队通过分析 RNA 测序数据和 qPCR 验证发现，脉动切应力（PS）可从 16 小时起显著下调人脐静脉内皮细胞中糖酵解途径相关酶的基因表达，而振荡切应力（OS）则呈现相反作用（图 1A和1B）。结合 ATAC-seq 实验进一步证实，PS 对糖酵解基因的抑制与染色质结构重塑相关 —— 在 OS 作用下，糖酵解基因启动子区域的染色质解聚程度（ATAC 峰富集）显著高于 PS 处理组（图 1C）。这表明 PS 在表观遗传和转录水平上系统性抑制内皮细胞的糖酵解过程，为揭示血流动力学调控血管代谢的分子机制提供了证据。

图1   PS抑制ECs中糖酵解基因的表达。

进一步研究发现，PS可显著诱导内皮细胞中葡萄糖激酶调节蛋白（GCKR）的转录（图 2A和2B)，且该过程由先锋转录因子 KLF4 介导。PS 处理使 GCKR 启动子区域的 H3K27ac 组蛋白修饰富集（图 2C），提示染色质结构解聚以促进转录激活。通过分析转录因子结合位点及 RNA 测序数据，发现 KLF4 是 PS 诱导下与 GCKR 启动子结合显著的转录因子（图 2D和2E）。过表达 KLF4 可增强其与 GCKR 启动子的结合并上调 GCKR 表达（图 2 F-H），而敲低 KLF4 则削弱 PS 对 GCKR 的诱导作用（图 2I和2J）。与这些结果一致，PS 增加了 KLF4 与 GCKR 启动子的结合并增强了 GCKR 表达（图 2 B, K 和 L）。在小鼠体内，抗动脉粥样硬化血流模式下的胸主动脉内膜中 GCKR mRNA 水平显著高于致动脉粥样硬化区域的主动脉弓（图 2M）。这些结果表明 PS 诱导的 GCKR 依赖于 KLF4 介导的表观遗传和转录调控。

图2   KLF4 响应PS调节GCKR的表达。

接着，为了确定 PS 诱导的 GCKR 是否涉及蛋白质磷酸化，研究人员通过生物信息学预测和体外激酶实验证实，AMPK 能直接磷酸化 GCKR 的 Ser-481 位点，该位点与 AMPK 磷酸化共有序列高度同源，突变该位点会显著减弱磷酸化水平（图 3A和3B）。在细胞实验中，PS 处理可增强 GCKR Ser-481 磷酸化，而 AMPK 敲除则消除了这一效应（图 3C）。功能上，磷酸化的 GCKR（如 S481D 模拟物）可增强与 HK1 的结合，抑制 HK1 活性，而未磷酸化的 S481A 则削弱这种相互作用并提升 HK1 活性（图 3D和3E）。体内实验进一步表明，AMPKα2 存在时，小鼠胸主动脉中 GCKR Ser-481 磷酸化及与 HK1 的结合显著增加（图 3F和3G）。总之，PS 通过激活 AMPK 介导 GCKR Ser-481 磷酸化，促进 GCKR 与 HK1 结合以抑制糖酵解关键酶活性，揭示了翻译后修饰在血流动力学调控血管代谢中的关键作用。

图3   AMPK 磷酸化并调节GCKR。

最后，为了证实 KLF4-AMPK/GCKR 在体内抑制内皮细胞糖酵解，研究人员通过高跑量（HR）小鼠模型进行验证。HR 小鼠因心输出量增加，主动脉中脉动切应力（PS）升高，伴随 AMPK 活性增强。实验显示，HR 小鼠主动脉中糖酵解相关基因表达下调（图 4A），而 KLF4 与 GCKR 启动子结合增强，导致 GCKR 的 mRNA 和蛋白水平显著升高（图 4B-D）。同时，AMPK 介导的 GCKR Ser-481 磷酸化及 GCKR-HK1 结合作用增强（图 4E和4F） ，进而降低 HK1 活性（图 4G）。这表明有氧运动 可能有益于血管内皮的能量利用，且这种有益结果由 GCKR 表达和活性的增加介导。其潜在机制应分别包括 KLF4 在转录水平和 AMPK 在翻译后水平的调节（图 5）。

图4  KLF4-AMPK/GCKR对HR 小鼠糖酵解的抑制作用。

图5  PS通过 KLF4 和 AMPK 抑制ECs糖酵解的示意图。

总之，文章阐明了血流通过机械转导调控血管内皮糖酵解的机制：抗动脉粥样硬化的脉动切应力（PS）在体外和体内均可抑制内皮细胞的糖酵解。具体而言，PS 可上调糖酵解抑制剂 GCKR 的表达，同时下调其他糖酵解相关基因。机制上，PS 诱导的先锋转录因子 KLF4 通过表观遗传重塑 GCKR 启动子，促进其转录激活；同时，PS 激活的 AMPK 可磷酸化 GCKR，增强其与糖酵解关键酶己糖激酶的结合，从而抑制糖酵解通量。本研究为血流动力学调控血管代谢及运动干预血管健康提供了新的理论基础。

参考文献：Han Y, He M, Marin T, Shen H, Wang WT, Lee TY, Hong HC, Jiang ZL, Garland T Jr, Shyy JY, Gongol B, Chien S. Roles of KLF4 and AMPK in the inhibition of glycolysis by pulsatile shear stress in endothelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2021 May 25;118(21):e2103982118. doi: 10.1073/pnas.2103982118. PMID: 34001623; PMCID: PMC8166073.

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