一、背景

尼氏染色試劑盒(甲基紫法)主要由甲基紫染色液、分化液等組成。尼氏物質(zhì)呈紫黑藍(lán)色,神經(jīng)元呈淡紫藍(lán)色,細(xì)胞核呈紫藍(lán)色。

神經(jīng)元細(xì)胞體包括一個(gè)具有皺褶核膜的大細(xì)胞核、稀疏的染色質(zhì)和一個(gè)明顯的核仁。在細(xì)胞體中細(xì)胞質(zhì)是尼氏顆粒，即能夠代表粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并在很多神經(jīng)元中產(chǎn)生特異的斑點(diǎn)狀嗜堿性表現(xiàn)的嗜堿性顆粒。

尼氏顆?？梢杂煤芏嗳旧珌?lái)顯示如中性紅、亞甲基藍(lán)、甲苯胺藍(lán)和甲基紫等。染色的變異、pH和分化的時(shí)間使一些染色既可以僅突出尼氏物質(zhì)，也可以顯示神經(jīng)元的細(xì)胞核和神經(jīng)膠質(zhì)。

尼氏體(Nissl body)或稱尼氏小體是分布于神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的三角形或橢圓形小塊狀物質(zhì)，能被堿性染料如硫堇、亞甲藍(lán)、甲苯胺藍(lán)和焦油紫等染料染成紫藍(lán)色。各種神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)都含有尼氏體，但其形狀、數(shù)量、分布位置常常不同。

尼氏體也存在于樹(shù)突中，但不在于軸突和包體的軸丘。尼氏體會(huì)因?yàn)樯頎顟B(tài)的變化而變化，尼氏體是神經(jīng)元內(nèi)合成蛋白質(zhì)合成的重要部位，當(dāng)神經(jīng)元受到刺激后，包體內(nèi)的尼氏體會(huì)明顯減少。

二、自備材料

1、中性福爾馬林溶液

2、顯微鏡

3、蒸餾水

三、參考操作

1、固定:可采用乙醇、Carnoy固定液或中性福爾馬林溶液。

2、組織切片:石蠟切片7-10μm或25μm(見(jiàn)注意事項(xiàng)4)。

3、切片脫蠟入水。

4、用甲基紫染色液涂片，染色10-20min。

5、蒸餾水沖洗。

6、用Nissl Differentiation分化4-8s，直到大部分染色被消除。

四、應(yīng)用

尼氏染色試劑盒(甲基紫法)可以用于神經(jīng)干細(xì)胞移植治療血管性癡呆大鼠的研究：

大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)及慢病毒介導(dǎo)GFP轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)研究目的原代培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞，并在體外繼續(xù)分裂增殖、穩(wěn)定傳代，慢病毒介導(dǎo)GFP轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞后，可做為移植的種子細(xì)胞，滿足細(xì)胞移植需要。

材料與方法：以健康孕15天Wistar大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，體外分離并原代培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞，之后傳代培養(yǎng)，并進(jìn)行單細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)。免疫熒光法和免疫組化SP法對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分進(jìn)行鑒定，Lentivirus介導(dǎo)轉(zhuǎn)染NSCs。

結(jié)果：1、原代培養(yǎng)細(xì)胞可形成數(shù)十個(gè)細(xì)胞聚集而成的小神經(jīng)球(Neurosphere)神經(jīng)球逐漸增大，7天時(shí)神經(jīng)球已生長(zhǎng)成為數(shù)百個(gè)細(xì)胞的大克隆，即可傳代培養(yǎng)。傳代第7天時(shí)已再次長(zhǎng)成為數(shù)百個(gè)細(xì)胞聚集的大克隆，將細(xì)胞連續(xù)傳代，細(xì)胞的生長(zhǎng)模式基本相同。

2、原代培養(yǎng)的神經(jīng)球經(jīng)分散﹑再擴(kuò)增得到的大量神經(jīng)球呈nestin抗原陽(yáng)性；神經(jīng)球可以分化為三種細(xì)胞，免疫熒光法和免疫組化SP法檢測(cè)三種細(xì)胞分別呈NSE、CNP、GFAP陽(yáng)性。

3、慢病毒介導(dǎo)GFP轉(zhuǎn)染NSCs后，熒光顯微鏡下觀察，可見(jiàn)NSCs攜帶綠色熒光。

結(jié)論：1、從大鼠胚胎(孕15天)腦組織中分離的神經(jīng)干細(xì)胞在體外可繼續(xù)分裂增殖、穩(wěn)定傳代，可滿足細(xì)胞移植需要。

2、慢病毒介導(dǎo)GFP轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞，標(biāo)記后的神經(jīng)干細(xì)胞做為移植的種子細(xì)胞，便于在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行跟蹤研究。

NSCs移植治療大鼠血管性癡呆的實(shí)驗(yàn)研究目的將慢病毒介導(dǎo)GFP標(biāo)記的NSCs通過(guò)海馬立體定向注射的方法移植到血管性癡呆模型大鼠，使海馬周圍的NSCs數(shù)量增加，用Morris水迷宮檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠作定位航行試驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)測(cè)試，檢測(cè)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力的改變，觀察NSCs移植的治療效果。

材料與方法：月齡12～15個(gè)月健康成年Wistar大鼠，體重300～400g，用來(lái)制備血管性癡呆2VO模型；傳代至第6代的Wistar大鼠神經(jīng)干細(xì)胞，GFP標(biāo)記后于2VO模型造模35天后海馬立體定向注射移植，對(duì)假手術(shù)組、對(duì)照組、NSCs移植組海馬組織切片做尼氏染色，觀察病理學(xué)改變；在缺血4、9、13、17周（移植前和移植后4周、8周、12周）時(shí)對(duì)移植前后各組大鼠行Morris水迷宮測(cè)試，對(duì)定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

結(jié)果：1、神經(jīng)干細(xì)胞移植1周后，大鼠海馬區(qū)冰凍切片顯示有綠色熒光存在，證明神經(jīng)干細(xì)胞可在海馬區(qū)域存活、增殖。

2、缺血4周時(shí)（移植前），NSCs移植組與對(duì)照組大鼠各項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)顯著性差異，但二者與假手術(shù)組相比均有顯著性差異。缺血9、13、17周（移植后4周、8周、12周）時(shí)，NSCs移植組大鼠逃避潛伏期較對(duì)照組均明顯縮短（P<0.05），但與假手術(shù)組相比仍明顯延長(zhǎng)；NSCs移植組穿越平臺(tái)區(qū)次數(shù)較對(duì)照組也明顯增加（P<0.05），與假手術(shù)組相比仍明顯減少(P<0.01)；NSCs移植組大鼠平臺(tái)所在象限停留的時(shí)間百分比較對(duì)照組明顯增加（P<0.05，移植后12周除外），但與假手術(shù)組相比仍明顯減少(P<0.05)。

3、NSCs移植組尼氏染色顯示神經(jīng)元丟失、變性情況較對(duì)照組有明顯改善，神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)較完整，胞漿內(nèi)尼氏小體相對(duì)較豐富。結(jié)論神經(jīng)干細(xì)胞移植到VaD大鼠模型中后，可在一定程度上改善VaD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

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