一、實驗準備

1、hPSC誘導分化肺類器官試劑盒（abs90128-1kit）

產(chǎn)品組成：

2、輔助試劑

3、實驗耗材

 二、誘導流程圖

三、培養(yǎng)方法

1、hPSC分化為內胚層細胞（DE） （按6孔板1孔算）
（1）基質膠在4℃下解凍，與DMEM/F12均勻混合，鋪板，備用。
（2）當hiPSC的匯合度達到75%-85%，吸去培養(yǎng)基，用2mL 1x室溫PBS（不含Ca²⁺/Mg²⁺)清洗hiPSC，吸去PBS。
（3）加入1mL含Y-27632（10 μM）的室溫Accutase，轉移到37℃ 5% CO₂細胞培養(yǎng)箱中20 min，使其解離成單細胞。
（4）20 min后，將hESC/iPSC 培養(yǎng)基以等體積直接加入Accutase中，并使用P-1000吸頭輕輕上下吹打細胞，制成單細胞懸液，將細胞單懸液收集到15mL離心管中，室溫下300 g離心5 min。
（5）從基質膠包被的板中小心地抽吸包被液而不損壞基質膠涂層表面。
（6）離心結束，充分去除上清，將1 mL預熱的Advance 人多能干細胞培養(yǎng)基（含10μM Y-27632）重懸細胞，輕輕地上下移液以確保單細胞溶液均勻。
（7）使用自動細胞計數(shù)器計數(shù)細胞，使用臺盼藍排除死亡細胞，將密度為2.0 *10⁵個細胞/mL的細胞接種到步驟1制備的6孔基質膠包被的板上，在6孔板中每孔最終體積為2 mL，將孔板轉移到37℃、5%CO₂細胞培養(yǎng)箱中孵育24h。
（8）24h后（第1天）吸去培養(yǎng)基，并加入1.97mL基礎培養(yǎng)基1+10μL補充劑A+20μL補充劑B。
（9）在第2天和第3天，吸去培養(yǎng)基，加入1.98mL基礎培養(yǎng)基1+20μL補充劑B，開始分化為內胚層細胞。

2、DE誘導分化為前腸內胚層細胞(AFE)
（1）第4天，從培養(yǎng)物中抽吸培養(yǎng)基，在6孔板中每孔用2 mL1x室溫PBS（不含Ca²⁺/Mg²⁺)清洗培養(yǎng)物，然后從孔中移除PBS，每孔加入2 mL基礎培養(yǎng)基2。
（2）將培養(yǎng)板放入37℃ 5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24h更換一次培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)3天。

3、AFE誘導分化為肺祖細胞(LPC)（以12孔板4個孔為例）
（1）29.92mL基礎培養(yǎng)基3+80μL補充劑C配成LPC誘導培養(yǎng)基
（2）第7天，從培養(yǎng)物中抽吸培養(yǎng)基，在6孔板中每孔用2 mL1x室溫PBS（不含Ca²⁺/Mg²⁺)清洗培養(yǎng)物，吸去PBS。
（3）每孔加入1mL含Y-27632（10 μM）的室溫Accutase，將培養(yǎng)物置于37℃ 5%CO₂細胞培養(yǎng)箱中孵育10 min。
（4）10 min后每孔加入1mL DMEM/F12（含10μM Y-27632），輕輕吹打細胞，使細胞脫離孔底。
（5）將細胞懸液收集到15 mL離心管中，室溫下300 g離心5 min。
（6）仔細抽吸上清液，不干擾細胞，用1mL恢復室溫的LPC誘導培養(yǎng)基（含10μM Y-27632）重懸細胞，輕輕地上下移液以確保單細胞溶液均勻。
（7）使用自動細胞計數(shù)器計數(shù)細胞，使用臺盼藍排除死亡細胞，將密度為2.0 x10⁵個細胞/mL的細胞接種到提前制備的12孔基質膠包被的板上，在12孔板中每孔培養(yǎng)基最終體積為1 mL。
（8）第二天，更換為不含Y-27632的LPC誘導培養(yǎng)基。每隔一天更換培養(yǎng)基，持續(xù)11天。

4、LPC誘導分化為3D肺類器官（以24孔板6個孔為例）
（1）第18天，14.965mL基礎培養(yǎng)基4+35μL補充劑D配制成3D類器官誘導培養(yǎng)基
（2）在冰上解凍基質膠，并將移液器吸頭提前置于-20℃冰箱中。
（3）吸出LPC誘導培養(yǎng)基，用1 mL1xPBS（不含Ca²⁺/Mg²⁺)洗滌1次。
（4）加入含10μM Y-27632的室溫Accutase（0.5 mL/12孔）并在37℃、5% CO₂培養(yǎng)箱中孵育10 min；10 min后每孔加入1mL恢復室溫的DMEM/F12（含10μM Y-27632），輕輕吹打細胞，使細胞脫離孔底。
（5）將細胞懸液收集到15 mL離心管中，室溫下300 g離心5 min。
（6）仔細抽吸上清液，不干擾細胞，用1mL 3D類器官誘導培養(yǎng)基重懸細胞，輕輕地上下移液以確保單細胞溶液均勻。
（7）使用自動細胞計數(shù)器計數(shù)細胞，使用臺盼藍排除死亡細胞。
注意：每個細胞系必須優(yōu)化細胞數(shù)量；在分化的18天內，細胞不應變得過度融合。
（8）室溫下以300 g離心5 min，吸出培養(yǎng)基并將細胞重懸于冷基質膠中，對于ESC，每孔4.0*10⁴個細胞添加200μL基質膠，對于iPSC，每孔 8.0*10⁴個細胞，添加200 μL基質膠，將基質膠與細胞一起置于冰上。
（9）將200μL基質膠/細胞混合物按每孔30μL接種到24孔板中。
（10）將板置于37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中20-30分鐘使基質膠凝固。
（11）每孔加入700μL 3D類器官誘導培養(yǎng)基，并每隔一天更換培養(yǎng)基，持續(xù)6天。
（12）在第23天，14.96mL基礎培養(yǎng)基5+40μL補充劑E配制成3D類器官分化培養(yǎng)基，將孔里的培養(yǎng)基更換為700μL恢復室溫的3D類器官分化培養(yǎng)基，每隔一天更換培養(yǎng)基，持續(xù)6天。
（13）在第29天，199.48mL基礎培養(yǎng)基6+520μL補充劑F配制成3D類器官成熟培養(yǎng)基，將孔里的培養(yǎng)基更換為700μL恢復室溫的3D類器官成熟培養(yǎng)基，每隔一天更換培養(yǎng)基，進行長期培養(yǎng)。

5、3D肺類器官傳代
（1）取出冷凍的基質膠置于4℃解凍，并提前將槍頭放置在-20℃預冷1h；
（2）吸除培養(yǎng)基，加入1mL預冷的類器官傳代消化液，靜置1min；
（3）使用1mL移液槍，吹打孔中混合物40-50次，注意：不要產(chǎn)生氣泡；
（4）每孔加入1mL預冷的PBS，將混合物轉移到15mL離心管中；
（5）用1mL預冷的PBS清洗培養(yǎng)板，并將該清洗液加入上一步的離心管中，并補充預冷的PBS，使離心管中的終體積為12mL；300g離心5min，去上清；
（6）用預冷槍頭按每孔30μL的量在離心管中加入適量的基質膠，吹打5-8次，均勻混合單細胞-基質膠，注意吹打過程中避免產(chǎn)生氣泡；
（7）將提前放在培養(yǎng)箱中的24孔板取出，在孔中心位置加入30μL膠滴，緩慢打入混合液時，逐漸向上移動槍頭，使細胞均勻分布在膠中；
（8）將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中，20-30min，使膠滴凝固；
（9）小心沿孔壁加入700μL恢復室溫的3D類器官成熟培養(yǎng)基，每隔1天換液一次（可周一、周三、周五換液，周五可添加至800μL，周六、周日不換液），注意：不要碰到膠滴，將孔板放到培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)。