大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤 PC-12分化细胞操作步骤

分化诱导阶段
当细胞密度达到60%-70%汇合时，更换为含1%马血清和100ng/ml NGF（神经生长因子）的低血清分化培养基。注意保持培养基pH值在7.2-7.4之间，每2天更换新鲜分化培养基。此阶段需特别注意：①使用经0.1%多聚赖氨酸预处理的培养皿增强细胞贴附；②培养箱湿度维持在95%以避免培养基蒸发造成的渗透压变化。

形态学观察
分化第3天起，在倒置相差显微镜下可观察到特征性改变：胞体逐渐伸长，从圆形上皮样向梭形神经元样转变，并开始伸出细长突起。建议每日拍摄固定视野的时序照片，使用ImageJ软件量化神经突长度（≥2倍胞体直径视为有效突起）。典型分化过程约需7-10天，当50%以上细胞呈现明显神经突时可判定分化成功。

 功能验证
分化完成后可通过以下方法验证：①免疫荧光检测神经元特异性烯醇化酶（NSE）和β-微管蛋白III表达；②钙成像检测细胞对高钾溶液的钙响应；③采用微电极阵列（MEA）记录自发放电活动。注意实验需设置未分化细胞对照组。
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注意事项
1. 严格把控NGF活性：分装储存于-80℃，避免反复冻融
2. 分化期间禁止使用胰蛋白酶消化，需换液时采用温和的PBS冲洗
3. 出现过度聚集现象时，可加入2μM胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷抑制非神经元细胞增殖。