一、背景

大鼠氣管上皮細(xì)胞是一種在實(shí)驗(yàn)室研究中常用的細(xì)胞類型。這些細(xì)胞通常來自大鼠的氣管組織，并被培養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室中以研究各種生理和病理過程。

在近端下呼吸道的上皮表面，主要是纖毛上皮細(xì)胞，它與基底細(xì)胞及杯狀細(xì)胞一起構(gòu)成假?gòu)?fù)層上皮，到達(dá)氣管腔。

這些細(xì)胞可以用于各種實(shí)驗(yàn)，例如藥物篩選、毒理學(xué)測(cè)試、免疫學(xué)研究等。然而，需要注意的是，這些細(xì)胞是經(jīng)過人工培養(yǎng)的，可能存在一些與天然組織不同的特性。

二、大鼠氣管上皮細(xì)胞培養(yǎng)操作

1)復(fù)蘇大鼠氣管上皮細(xì)胞：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。

將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2)大鼠氣管上皮細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤(rùn)所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3)大鼠氣管上皮細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。

下面T25瓶為例；

a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

三、應(yīng)用

大鼠氣管上皮細(xì)胞可以用于苯并（a）芘對(duì)大鼠氣管—支氣管上皮細(xì)胞p16、RASSF1A基因甲基化的影響：

觀察不同濃度的苯并(a)芘在不同時(shí)間對(duì)原代培養(yǎng)的大鼠氣管上皮細(xì)胞p16、RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度的影響。

方法：

(1)采用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)原代大鼠氣管上皮細(xì)胞；

(2)噻唑蘭(MTT)還原實(shí)驗(yàn)檢測(cè)系列苯并(a)芘濃度和不同作用時(shí)間對(duì)原代大鼠氣管上皮細(xì)胞增殖活性的影響；

(3)應(yīng)用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(MSP)檢測(cè)不同濃度的苯并(a)芘對(duì)原代大鼠氣管上皮細(xì)胞p16、RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度的影響。

結(jié)果：

(1)在本實(shí)驗(yàn)室成功建立了用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)原代大鼠氣管上皮細(xì)胞的方法；

(2)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示苯并(a)芘濃度在10.0μmol/L及以下時(shí)，72h內(nèi)大鼠氣管上皮細(xì)胞抑制率均小于50%，具有明顯的抑制增殖作用，并呈劑量依賴性；

(3)以0.1、1.0、10μmol/L的苯并(a)芘分別處理原代大鼠氣管上皮細(xì)胞24h、48h、72h后，發(fā)現(xiàn)p16和RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)均未發(fā)生甲基化，并通過測(cè)序驗(yàn)證。

結(jié)論：

(1)組織塊培養(yǎng)法是培養(yǎng)原代大鼠氣管-支氣管上皮細(xì)胞的較好方法，方法簡(jiǎn)便，易操作；

(2)苯并(a)芘對(duì)大鼠氣管-支氣管上皮細(xì)胞的毒性隨著苯并(a)芘濃度的增大而增大，具有明顯的抑制增殖作用，并呈劑量依賴性；

(3)0.1、1.0、10μmol/L的苯并(a)芘對(duì)原代大鼠氣管-支氣管上皮細(xì)胞分別作用24h、48h、72h，不會(huì)引起p16、RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化。

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