一、背景

TSCCA人舌鱗癌貼壁細胞系是由湖北醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院建立，細胞常規(guī)培養(yǎng)在RPMI＋15％小牛血清的培養(yǎng)液中。TSCCa細胞系是被HELA污染的細胞系。

二、TSCCA人舌鱗癌貼壁細胞系培養(yǎng)操作

1）復蘇TSCCA人舌鱗癌貼壁細胞系細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或將細胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。

2）TSCCA人舌鱗癌貼壁細胞系細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

3.按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4.將細胞懸液按1：2比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

3）TSCCA人舌鱗癌貼壁細胞系細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。

下面T25瓶為類；

1.細胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，細胞變圓脫落后，加入1ml含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計數(shù)板計數(shù)。

2.4 min 1000rpm離心去掉上清。加1ml血清重懸細胞，根據(jù)細胞數(shù)量加入血清和DMSO，輕輕混勻，DMSO終濃度為10%，細胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存1ml細胞懸液，注意凍存管做好標識。

3.將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，2個小時以后轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

三、應用

TSCCA人舌鱗癌貼壁細胞系可以用于轉染IL-18基因聯(lián)合二萜生物堿對舌鱗癌細胞Tscca的增殖抑制與促凋亡作用：

構建白介素-18(IL-18)真核表達載體,通過轉染技術將IL-18基因轉染入TSCCA人舌鱗癌貼壁細胞系,同時分別加入不同濃度的二萜生物堿(DA),分別采用流式細胞術、MTT實驗檢測細胞凋亡與增殖抑制情況,最后通過檢測Akt/p-Akt通路探究IL-18聯(lián)合二萜生物堿對TSCCA人舌鱗癌貼壁細胞系可能凋亡機制。

方法：

1、根據(jù)Gen Bank中IL-18 DNA序列,設計并合成IL-18基因特異性引物;

2、提取人新鮮血液中單個核淋巴細胞(PBMC),提PBMC的總RNA,RT-PCR方法獲得其c DNA,PCR擴增目的片段,構建PEGFPN3-IL-18真核表達質粒,經酶切和測序均鑒定正確后瞬時轉染TSCCA人舌鱗癌貼壁細胞系細胞,熒光顯微鏡下觀察質粒的轉染效率;

3、DMSO溶解二萜生物堿,調整其濃度為0.2 mg/ml、0.4 mg/ml、0.6 mg/ml;4、MTT法及流式細胞術檢測空白對照組(未處理Tscca細胞)、IL-18組(僅轉染IL-18)、單獨二萜生物堿組(分為0.2 mg/ml、0.4 mg/ml、0.6 mg/ml 3組)及聯(lián)合組(分為IL-18+0.2 mg/ml、IL-18+0.4 mg/ml、IL-18+0.6 mg/ml 3組)對TSCCA人舌鱗癌貼壁細胞系生長的影響與細胞凋亡情況;5、Western blot實驗檢測各組細胞信號調節(jié)激酶Akt/p-Akt的蛋白水平,分析IL-18聯(lián)合二萜生物堿是否在此條通路發(fā)揮一定作用從而抑制TSCCA人舌鱗癌貼壁細胞系的增殖。

結果：

1、成功構建PEGFPN3-IL-18真核表達質粒;

2、成功轉染舌鱗癌細胞,且熒光鏡下觀察轉染PEGFPN3-IL-18真核表達質粒的TSCCA人舌鱗癌貼壁細胞系細胞較未轉染細胞凋亡增加;

3、二萜生物堿濃度為0.2、0.4、0.6 mg/ml時,隨濃度增大TSCCA人舌鱗癌貼壁細胞系細胞凋亡增多,且均有p<0.05,差異有統(tǒng)計學意義;

4、IL-18與二萜生物堿聯(lián)合對Tscca細胞作用48 h后,較單獨使用二萜生物堿抑制作用明顯,且呈濃度依賴性,均有p<0.05,差異有統(tǒng)計學意義;5、IL-18聯(lián)合二萜生物堿還可劑量依賴性地降低p-Akt的蛋白水平,各組均有p<0.05,差異有統(tǒng)計學意義,而總Akt水平幾乎不變。

結論：

1、二萜生物堿對TSCCA人舌鱗癌貼壁細胞系細胞有增殖抑制及促凋亡作用,且呈濃度依賴性;

2、IL-18聯(lián)合二萜生物堿對TSCCA人舌鱗癌貼壁細胞系有協(xié)同抑制作用,且抑制作用較單獨使用IL-18或二萜生物堿均較強;

3、IL-18聯(lián)合二萜生物堿在抑制p-Akt的表達及活化這條信號通路上發(fā)揮一定作用從而抑制TSCCA人舌鱗癌貼壁細胞系的增殖并促進其凋亡。

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