細(xì)胞培養(yǎng)基的種類(lèi)繁多，細(xì)胞培養(yǎng)方式也較多，如何正確地使用培養(yǎng)基及地保持培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)以維持細(xì)胞的生長(zhǎng)，對(duì)每個(gè)培養(yǎng)者都很重要。培養(yǎng)基的使用依不同的培養(yǎng)基種類(lèi)、培養(yǎng)方式、細(xì)胞種類(lèi)的不同而存在差異。

一、細(xì)胞培養(yǎng)液的構(gòu)成

細(xì)胞培養(yǎng)液指細(xì)胞生長(zhǎng)的液體環(huán)境，一般指培養(yǎng)液，添加了血清、水解乳蛋白、各種添加劑等可以直接使用的培養(yǎng)液。

1、細(xì)胞培養(yǎng)基&血清模式

血清對(duì)于在傳統(tǒng)培養(yǎng)基配方中生長(zhǎng)和增殖的大多數(shù)細(xì)胞系來(lái)說(shuō)是需要的，因?yàn)榇蠖鄶?shù)單獨(dú)的培養(yǎng)基并不能提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需要的全部營(yíng)養(yǎng)，如MEM培養(yǎng)基，較為常用的量為5％～10％的比例，而特殊的低血清培養(yǎng)基血清量可降至3％左右，細(xì)胞的形態(tài)和功能不受影響。

2、細(xì)胞培養(yǎng)基&乳歐液模式

化學(xué)合成培養(yǎng)基現(xiàn)雖已大規(guī)模使用，但在某些培養(yǎng)領(lǐng)域水解乳蛋白仍在使用，以補(bǔ)充培養(yǎng)液中缺乏的氨基酸、小肽物質(zhì)。較為常用的方式是用漢氏（Hanks’ BSS）或歐式(Earle’s BSS)平衡液溶解水解乳蛋白（一般為5‰濃度），即成乳漢（歐）液，再與化學(xué)合成培養(yǎng)基（一般為MEM）按比例混合使用（如1：1）。

3、細(xì)胞培養(yǎng)基&各類(lèi)添加劑（生長(zhǎng)因子等）模式

成分復(fù)雜的培養(yǎng)基還含有許多化合物，包括蛋白質(zhì)、多肽、核苷、檸檬酸循環(huán)的中間產(chǎn)物、丙酮酸及脂類(lèi)等。已發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)基中的血清濃度減少時(shí)，這些成分都是必需的。既使在使用血清的情況下，這些成分也可幫助細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)及維持某些特殊細(xì)胞系的生長(zhǎng)。激素和生長(zhǎng)因子在大多數(shù)常規(guī)培養(yǎng)基的配方中都沒(méi)有注明，但在無(wú)血清培養(yǎng)基中通常要加入它們，用其來(lái)代替血清中的激素能增加多種不同類(lèi)型細(xì)胞的貼瓶率；生長(zhǎng)因子包括FGF家族、EGF、PDGF、IGF－1和IGF－2及白介素等，生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子有著廣泛的特異性，一般與激素或其它物質(zhì)起相互協(xié)同或加成作用。另一種常見(jiàn)的添加物就是血清替代物，目前已有許多可或部分替代傳統(tǒng)培養(yǎng)液中血清成分的商業(yè)產(chǎn)品，其穩(wěn)定性較好，但批次間仍有差別，產(chǎn)品的成分也不很確定。

二、細(xì)胞培養(yǎng)基配制

1、干粉培養(yǎng)基原倍液的配制

1）配制過(guò)濾除菌的細(xì)胞培養(yǎng)基

(1)閱讀培養(yǎng)基使用說(shuō)明，確定需要添加何種添加劑（如NaHCO3、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES等）。

(2)根據(jù)所需將培養(yǎng)基全部倒入一容器中，用少量注射用水（20℃～30℃）將袋內(nèi)殘留培養(yǎng)基洗下，并入容器。加注射用水至總體積的95％，輕微攪拌溶解。

(3)加入規(guī)定量的碳酸氫鈉及所要添加的物質(zhì)。

(4)輕微攪拌溶解，加注射用水至規(guī)定體積。

(5)用1 mol / L 氫氧化鈉溶液或 1 mol / L 鹽酸溶液調(diào)pH至所需值。

(6)用0.22 μm濾膜正壓過(guò)濾除菌。

(7)溶液應(yīng)在2℃－8℃下避光保存。

具體使用方法參照培養(yǎng)基包裝袋上的說(shuō)明書(shū)。

2）配制可高壓滅菌細(xì)胞培養(yǎng)基

(1)根據(jù)所需將培養(yǎng)基全部倒入一容器中，用少量注射用水（20℃～30℃）將袋內(nèi)殘留培養(yǎng)基洗下，并入容器。加注射用水至總體積的95％，輕微攪拌溶解。

(2)在121℃、15psi下滅菌15分鐘。

(3)待溶液冷卻至室溫，加入無(wú)菌0.2 mol / L L－谷氨酰胺溶液規(guī)定體積、無(wú)菌7.5％（w/v）碳酸氫鈉溶液規(guī)定體積，加注射用水（20℃～30℃）至規(guī)定體積，混勻。

(4)如果必要，用1 mol / L 氫氧化鈉溶液或 1 mol / L 鹽酸溶液調(diào)pH至所需值。

(5)溶液應(yīng)在2℃－8℃下避光保存。

具體使用方法參照培養(yǎng)基包裝袋上的說(shuō)明書(shū)

2、注意事項(xiàng)

1）細(xì)胞培養(yǎng)用水一般為三蒸水（經(jīng)石英蒸餾器蒸餾）或超純水，醫(yī)藥生產(chǎn)上一般為注射用水。

2）建議盡量選擇與所用量相匹配的包裝一次使用，因?yàn)榘b一旦打開(kāi)，組分可能會(huì)變質(zhì)或因受潮而結(jié)團(tuán)。

3）溶解干粉培養(yǎng)基時(shí)先加入終體積90％－95％的培養(yǎng)用水，添加劑加完后再補(bǔ)足。

4）如需添加的組分較多時(shí)，某一組分溶解后，再添加另一組分。

5）待培養(yǎng)基溶解后再加入碳酸氫鈉，以免產(chǎn)生沉淀。

6）所有成分溶解后，培養(yǎng)基應(yīng)立即過(guò)濾或高壓除菌，以免產(chǎn)生沉淀或有微生物污染。

7）在過(guò)濾除菌時(shí)，一般情況下應(yīng)調(diào)pH比所需值低0.1～0.2個(gè)單位，因過(guò)濾除菌后，pH值會(huì)升高約0.2。

8）在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，建議不加或加少量的抗生素，如血清的濃度較低則所加抗生素的量也要相應(yīng)降低一些。

9）建議用1 N HCl或1 N NaOH來(lái)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH，因?yàn)橛锰妓釟溻c來(lái)調(diào)對(duì)培養(yǎng)液的滲透壓影響比較大。

三、培養(yǎng)基滅菌

培養(yǎng)基的滅菌方法主要有兩種，高壓除菌及0.22 um微孔濾膜過(guò)濾除菌。與過(guò)濾相比，高壓滅菌的工作強(qiáng)度小，相對(duì)便宜，失敗率低，但易造成營(yíng)養(yǎng)成分的流失。

1、高壓滅菌

某些培養(yǎng)基（如MEM）可進(jìn)行高壓滅菌，例如清大天一的MEM培養(yǎng)基中的MD605、MD609等。其中不含有L-谷氨酰胺和碳酸氫鈉，可在高壓滅菌后加入。另外可高壓的谷氨酸鹽（如L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）可代替L-谷氨酰胺。

為保證高壓滅菌的效果，滅菌設(shè)備的驗(yàn)證很關(guān)鍵，可高壓滅菌的培養(yǎng)基在121℃、15psi，15分鐘的條件下可達(dá)到滅菌效果及營(yíng)養(yǎng)成分的最小損失，因此不需將滅菌時(shí)間延長(zhǎng)。

2、過(guò)濾滅菌

大多數(shù)培養(yǎng)基采用0.1～0.2 μm孔徑的微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾滅菌，并且已成為培養(yǎng)基除菌的發(fā)展方向，它可低限度地減少培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)損失。

四、細(xì)胞培養(yǎng)液的儲(chǔ)存

細(xì)胞培養(yǎng)液的儲(chǔ)存條件一般為2－8℃、密閉、避光保存，但要注意如下幾點(diǎn)：

1）過(guò)濾后的培養(yǎng)液，即添加了血清、谷氨酰胺、抗生素等的培養(yǎng)液要盡快使用，一般在2－3周內(nèi)使用完。培養(yǎng)液中的L-谷氨酰胺是不穩(wěn)定的，不同溫度L－谷氨酰胺的降解。

2）滅菌后的未加L-谷氨酰胺等添加劑的培養(yǎng)基溶液，一般可在4℃保存6～9個(gè)月，也可冷凍保存，用時(shí)解凍。

3）高壓除菌后的培養(yǎng)基應(yīng)置4℃保存，不能因?yàn)槠淇赡褪芨邷囟雎詢(xún)?chǔ)存溫度。

4）添加某些生長(zhǎng)因子、激素等添加物，可能會(huì)改變培養(yǎng)液的儲(chǔ)存條件，比如溫度、時(shí)間等方面的要求。

北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司擁有對(duì)菌種、細(xì)胞、培養(yǎng)基、配套試劑等產(chǎn)品需求者的極優(yōu)質(zhì)服務(wù)，對(duì)購(gòu)買(mǎi)項(xiàng)目的前期資料提供,中期合同保證,后期貨物跟蹤到最終售后的確保項(xiàng)目準(zhǔn)確到位，都有相關(guān)人士進(jìn)行維護(hù),確保您在微生物菌種查詢(xún)網(wǎng)中獲得優(yōu)質(zhì)服務(wù)！也正因?yàn)榇?，北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司與國(guó)內(nèi)外多家研制單位、生物制藥、第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)和科研院所院校、化工企業(yè)有著良好、長(zhǎng)期和穩(wěn)定的合作關(guān)系！