一、背景

小鼠胚胎成骨細胞前體細胞是一種廣泛用于成骨細胞學研究的細胞系。該細胞系是由美國國立衛(wèi)生研究院的納爾遜博士在1970年代初從小鼠胚胎組織中分離出來的。這些細胞具有較強的成骨分化能力，在細胞培養(yǎng)條件下能夠分化成成熟的骨細胞，并表達骨特異性基因。因此，小鼠胚胎成骨細胞前體細胞成為了研究骨細胞生物學、骨代謝、骨肉瘤等方面的理想模型。

二、小鼠胚胎成骨細胞前體細胞培養(yǎng)操作

1)復蘇小鼠胚胎成骨細胞前體細胞：以下細胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。

將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或將細胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。

2)小鼠胚胎成骨細胞前體細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

b、加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

d、將細胞懸液按1：2比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

3)小鼠胚胎成骨細胞前體細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。

下面T25瓶為例；

a、收集細胞及細胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細胞計數(shù)。

b、根據(jù)細胞數(shù)量加入無血清細胞凍存液，使細胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液，注意凍存管做好標識。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

三、應用

小鼠胚胎成骨細胞前體細胞可以用于MicroRNA-92a-1-5p調控小鼠胚胎成骨細胞前體細胞成骨分化的作用機制研究：

探究miR-92a-1-5p是否通過Wnt/β3-catenin信號通路調控MC3T3-E1細胞成骨分化,并闡述miR-92a-1-5p發(fā)揮調控作用的分子機制。

研究方法：

1、miR-92a-1-5p在BMP-2誘導MC3T3-E1成骨分化中的影響

(1)使用BMP-2誘導MC3T3-E1細胞進行成骨分化,通過qRT-PCR和Western Blot檢測誘導前后miR-92a-1-5p、ALP、Runx-2、OSX的表達水平。

(2)采用MTT法檢測誘導前后MC3T3-E1細胞的增殖情況。

(3)在MC3T3-E1細胞中構建miR-92a-1-5p過表達或低表達模型,采用qRT-PCR檢測過表達或干擾效率,以及ALP、Runx-2,OSX的表達情況,采用堿性磷酸酶試劑盒檢測ALP的活性。

(4)在MC3T3-E1細胞中轉染miR-92a-1-5p mimics或inhibitor,再誘導MC3T3-E1細胞成骨分化7天,通過茜素紅S法染色檢測成骨分化能力。

2、miR-92a-1-5p調控β-catenin抑制MC3T3-E1細胞成骨分化的作用機制研究

(1)結合文獻調研、生物信息學和在線數(shù)據(jù)庫分析預測miR-92a-1-5p的下游靶基因。

(2)在MC3T3-E1細胞中構建miR-92a-1-5p過表達或低表達模型,采用qRT-PCR、Western Blot檢測β-catenin的表達水平。

(3)在MC3T3-E1細胞中轉染miR-92a-1-5p mimics,再加入氯化鋰(Licl)干預48h,采用qRT-PCR檢測細胞中ββ-catenin、ALP、Runx-2、OSX的表達水平。

(4)在MC3T3-E1細胞中共轉染miR-92a-1-5p mimics和GSK-3ββsiRNA,采用qRT-PCR、Western Blot檢測β-catenin、Runx-2、ALP、OSX的表達水平。

(5)在MC3T3-E1細胞中轉染miR-92a-1-5p mimics,再加入氯化鋰(Licl)干預48h,然后再誘導MC3T3-E1細胞成骨分化7天,通過ARS染色檢測成骨分化能力。

研究結果：

1、miR-92a-1-5p在BMP-2誘導MC3T3-E1成骨分化中的影響

(1)使用BMP-2能夠成功誘導MC3T3-E1細胞成骨分化,隨著誘導時間的延長,細胞中miR-92a-1-5p的表達水平逐漸下調,而成骨分化相關因子ALP、Runx-2,OSX的mRNA的表達水平逐漸上調。

(2)誘導后MC3T3-E1細胞的形態(tài)為紡錘形、類長梭形或多角形,細胞核變大,但增殖能力比誘導前減弱。

(3)轉染了miR-92a-1-5pmimics后,細胞中成骨分化相關因子ALP、Runx-2,OSX的表達水平明顯下調,細胞中ALP的活性也明顯減弱;;而轉染了miR-92a-1-5p inhibitor后,細胞中成骨分化相關因子ALP、Runx-2,OSX的表達水平明顯上調,細胞中ALP的活性增強。

(4)在MC3T3-E1細胞中轉染了miR-92a-1-5p mimics并誘導成骨分化7天后細胞內形成的礦化結節(jié)明顯減少,而轉染了miR-92a-1-5pinhibitor并誘導成骨分化7天后,細胞內形成的礦化結節(jié)明顯增加。

2、miR-92a-1-5p調控β3-catenin抑制MC3T3-E1細胞成骨分化的作用機制研究

(1)分析預測結果發(fā)現(xiàn)miR-92a-1-5p可以與β-catenin的3’URT區(qū)域結合,說明miR-92a-1-5p的下游靶基因是β-catenin。

(2)轉染了miR-92a-1-5p mimics后,細胞中β-catenin的mRNA和蛋白表達水平明顯下調;而轉染了miR-92a-1-5p inhibitor后,β-catenin的mRNA和蛋白表達水平明顯上調。

(3)在MC3T3-E1細胞中轉染了miR-92a-1-5p mimics后,細胞中β-catenin和成骨分化相關因子ALP、Runx-2、OSX的表達水平明顯下調,而再加入氯化鋰(Licl)干預后,細胞中β-catenin和成骨分化相關因子ALP、Runx-2、OSX的表達水平明顯上調,顯示Licd可以部分逆轉miR-92a-1-5p對細胞中ββ-catenin和成骨分化相關因子表達的抑制作用。

(4)在MC3T3-E1細胞中共轉染了miR-92a-1-5p mimics和si-NC后,細胞中β-catenin、Runx-2蛋白表達水平明顯下調,成骨分化相關因子ALP、Runx-2、OSX的mRNA的表達水平也明顯下調;而在MC3T3-E1細胞中共轉染miR-92a-1-5p mimics和si-GSK-3β后,細胞中ββ-catenin、Runx-2的蛋白表達水平明顯上調,成骨分化相關因子ALP、Runx-2、OSX的mRNA的表達水平發(fā)生了上調,顯示miR-92a-1-5p mimics可能與GSK-3β的作用一樣,可以抑制下游靶基因ββ-catenin的表達。

(5)在MC3T3-E1細胞中成功轉染miR-92a-1-5pmimics,再加入氯化鋰(Licl)干預48h,然后再誘導成骨分化7天后,與轉染miR-92a-1-5p mimics相比,MC3T3-E1細胞成骨分化能力得到了增強。

結論：miR-92a-1-5p可以通過Wnt/β-catenin信號通路調控其關鍵蛋白β-catenin的表達,進而抑制MC3T3-E1細胞中成骨分化關鍵因子Runx-2、ALP、OSX的表達,最終抑制MC3T3-E1細胞的成骨分化。

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