概述

活/死細胞雙染色試劑盒在細胞分析領域應用廣泛，可精準區(qū)分活細胞與死細胞，助力細胞活性評估、藥物篩選及細胞凋亡研究等。其操作簡便、靈敏度高，結果可通過熒光顯微鏡或流式細胞儀直觀呈現(xiàn)。

前處理

細胞準備

無論是懸浮細胞還是貼壁細胞，在進行雙染色前需確保細胞狀態(tài)良好，密度適宜。細胞密度過高或過低均會影響染色效果及后續(xù)檢測準確性。懸浮細胞直接取適量細胞懸液，用預冷的 PBS 洗滌 2 - 3 次，離心去除培養(yǎng)基及雜質。貼壁細胞則先用胰酶消化，制成單細胞懸液，再按上述方法洗滌。洗滌過程動作輕柔，避免細胞過度離心導致?lián)p傷。

試劑準備

活/死細胞雙染色試劑盒通常包含兩種熒光染料，一種用于標記活細胞，如綠色熒光染料 Calcein-AM，另一種用于標記死細胞，如紅色熒光染料 PI（碘化丙啶）。使用前，先檢查試劑是否在有效期內，是否有變色、沉淀等現(xiàn)象。若有異常，不可使用。取適量染料，按試劑盒說明書推薦的比例用無菌水或 PBS 稀釋，配制成工作液。例如，Calcein-AM 常用濃度為 1 - 10 μM，PI 常用濃度為 1 - 20 μg/mL。配制好的工作液應立即使用，避免長時間放置導致活性下降。

染色步驟

加入染色液

將準備好的細胞懸液與染色工作液按一定比例混合，輕輕吹打混勻，使染料均勻分布于細胞周圍。對于 96 孔板培養(yǎng)的細胞，一般每孔加入 100 μL 染色工作液和 10 μL 細胞懸液，確保細胞充分接觸染料。

孵育

置于 37℃、5% CO?的培養(yǎng)箱中孵育 15 - 30 分鐘。孵育時間不宜過長，否則可能影響細胞活性，導致染色結果偏差。孵育過程中，細胞攝取染料并進行代謝反應。Calcein-AM 在活細胞內經酯酶作用轉化為具有熒光的 Calcein，發(fā)出綠色熒光；PI 則能穿透死細胞破損的細胞膜，與細胞核中的 DNA 結合，發(fā)出紅色熒光。

觀察與記錄

熒光顯微鏡觀察

孵育結束后，立即將染色后的細胞置于熒光顯微鏡下觀察。選擇合適的激發(fā)波長和發(fā)射波長，Calcein-AM 的激發(fā)波長為 490 - 515nm，發(fā)射波長為 515 - 530nm；PI 的激發(fā)波長為 535nm，發(fā)射波長為 617nm。通過調整光強和焦距，清晰看到綠色熒光標記的活細胞和紅色熒光標記的死細胞，可拍攝多張照片，記錄細胞形態(tài)及分布情況。

流式細胞儀分析

對于高通量、定量分析，將染色后的細胞用流式細胞儀檢測。設置合適的熒光通道，收集至少 10?個細胞的信號，得到散點圖，橫軸為 PI 熒光強度（代表死細胞），縱軸為 Calcein-AM 熒光強度（代表活細胞）。根據細胞在圖中的分布情況，準確計算活細胞和死細胞的比例。

注意事項

操作環(huán)境

整個操作過程需在無菌環(huán)境下進行，避免雜菌污染影響細胞狀態(tài)及染色結果。使用無菌移液器、離心管等器具，細胞培養(yǎng)箱、超凈工作臺等設備定期清潔消毒。

細胞處理

操作細胞時動作輕柔，避免用力吹打或劇烈振蕩，防止細胞受損。細胞計數時，使用血細胞計數板準確計數，確保細胞濃度符合實驗要求。

試劑使用

嚴格按照試劑盒說明書操作，不同品牌、型號的試劑盒組分和使用方法可能存在差異。使用過程中，避免染料接觸皮膚和眼睛，一旦接觸，立即用大量清水沖洗。

后續(xù)處理

實驗結束后，妥善處理廢棄物，如含染料的廢液、一次性耗材等，避免對環(huán)境造成污染。將未用完的試劑按說明書要求保存，如 4℃避光保存，以備下次使用。