ELISA酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定檢測(cè)方法及實(shí)驗(yàn)步驟-賽默飛

ELISA（酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)）是什么檢測(cè)方法？

ELISA是一種平板檢測(cè)技術(shù)，旨在檢測(cè)和定量肽、蛋白質(zhì)、抗體和激素等物質(zhì)。其他名稱(chēng)，比如酶免疫測(cè)定（EIA）也用于描述該的技術(shù)。在 ELISA 中，抗原必須固定化到固體表面，然后與連接到酶的抗體混合。通過(guò)與適當(dāng)?shù)牡孜锓跤?，測(cè)量報(bào)告基因酶的活性來(lái)產(chǎn)生可測(cè)量的產(chǎn)物，從而實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。該檢測(cè)策略中的最關(guān)鍵元素是高度特異性的抗體-抗原相互作用。

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本頁(yè)內(nèi)容

l ELISA 方法（直接、夾心等）

l 直接與間接檢測(cè) ELISA

l 競(jìng)爭(zhēng)性 ELISA 和其他方法 (競(jìng)爭(zhēng)性 ELISPOT 等)

l 整套即用型 ELISA 試劑盒

l 選擇和包被 ELISA 孔板

l 預(yù)包被 ELISA 孔板

l ELISA 的一抗

l 封閉緩沖液和洗滌緩沖液

l ELISA 檢測(cè)方式

ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定）檢測(cè)方法介紹

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 (ELISA) 是一種檢測(cè)和定量復(fù)雜混合物中特定蛋白質(zhì)的強(qiáng)大方法。該方法最初由 Engsorvall 和 Perlmann (1971) 描述，可使用特異性抗體分析固定在微孔板孔中的蛋白樣品。ELISA 通常在96孔（或384孔）聚苯乙烯孔板中執(zhí)行，它們可與抗體和蛋白質(zhì)被動(dòng)結(jié)合。試劑的這種結(jié)合和固定化使 ELISA 容易設(shè)計(jì)和執(zhí)行。讓 ELISA 的反應(yīng)物固定化到微孔板表面，使其容易在檢測(cè)過(guò)程中把結(jié)合與未結(jié)合材料分開(kāi)。具備洗掉非特異性結(jié)合材料的能力，使 ELISA 成為粗品制備中測(cè)量特異性分析物的強(qiáng)大工具。

盡管 ELISA 的許多變體已經(jīng)在不同的情況下開(kāi)發(fā)和使用，但它們都依賴(lài)于相同的基本元件：

1. 包被 / 捕獲—直接或間接將抗原固定在聚苯乙烯微孔板孔表面。

2. 板封閉—添加不相關(guān)蛋白質(zhì)或其他分子，以覆蓋微孔板孔中所有不飽和表面結(jié)合位點(diǎn)。

3. 檢測(cè) / 檢測(cè)—用與抗原結(jié)合的抗原特異性抗體進(jìn)行培養(yǎng)。

4. 信號(hào)測(cè)量—檢測(cè)特異性抗體上直接或二次標(biāo)記產(chǎn)生的信號(hào)。

酶標(biāo)記是辣根過(guò)氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（AP）。其他酶也已使用；這些酶包括 β - 半乳糖苷酶，乙酰膽堿酯酶和過(guò)氧化氫酶。使用 HRP 或 AP 偶聯(lián)物執(zhí)行 ELISA 時(shí)提供廣泛的底物選擇。底物選擇取決于所需的檢測(cè)靈敏度和可用于信號(hào)檢測(cè)的儀器（光吸收酶標(biāo)儀、熒光酶標(biāo)儀或發(fā)光酶標(biāo)儀）。

ELISA 檢測(cè)方法—直接，間接和夾心 ELISA

ELISA 使用有多種方法。這些分為直接，間接或夾心法捕獲和檢測(cè)方法。關(guān)鍵步驟是固定目標(biāo)抗原，通過(guò)直接吸附到檢測(cè)板或通過(guò)已附著在檢測(cè)板上的捕獲抗體間接完成。然后可以直接（標(biāo)記一抗）或間接（標(biāo)記二抗）檢測(cè)抗原。使用的 ELISA 檢測(cè)形式是夾心式 ELISA 檢測(cè)，可間接固定和間接檢測(cè)是否存在靶抗原。這種類(lèi)型的捕獲檢測(cè)稱(chēng)為“夾心”檢測(cè)，因?yàn)榇郎y(cè)分析物結(jié)合在兩種一抗之間，每種一抗檢測(cè)抗原的不同表位——捕獲抗體和檢測(cè)抗體。由于其靈敏度和特異性，夾心 ELISA 方法被高度使用。

圖1.常見(jiàn) ELISA 形式（直接與夾心檢測(cè)）的圖表。在檢測(cè)中，通過(guò)直接吸附到檢測(cè)板或首先將捕獲抗體連接到檢測(cè)板表面來(lái)固定目標(biāo)抗原。然后可以使用酶偶聯(lián)一抗（直接檢測(cè)）或者匹配的一組未標(biāo)記一抗和偶聯(lián)二抗（檢測(cè)檢測(cè)）執(zhí)行抗原檢測(cè)。

直接與間接 ELISA 檢測(cè)

在上面討論和說(shuō)明的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法中，捕獲和檢測(cè)的差異是值得關(guān)注的，采用專(zhuān)門(mén)用于檢測(cè)步驟的特定策略非常重要。與在孔板上捕獲抗體所采用的方法無(wú)關(guān)（通過(guò)直接吸附到表面，或者通過(guò)預(yù)包被“捕獲”抗體，與在夾心法 ELISA 中相同），檢測(cè)步驟（直接或間接檢測(cè)）很大程度上決定了 ELISA 的靈敏度。

直接檢測(cè)方法使用經(jīng)報(bào)告酶標(biāo)記的一抗或帶有與抗原直接反應(yīng)的標(biāo)記的一抗。執(zhí)行直接檢測(cè)時(shí)可以使用直接固定化到檢測(cè)板上的抗原或者采用捕獲檢測(cè)形式。雖然直接檢測(cè)在 ELISA 中未廣泛使用，但是在組織和細(xì)胞的免疫組織化學(xué)染色中卻很常見(jiàn)。

間接檢測(cè)方法使用標(biāo)記的二抗或生物素-鏈霉親和素復(fù)合物進(jìn)行擴(kuò)增，是 ELISA 形式。二抗對(duì)一抗具有特異性。在夾心法 ELISA 中，關(guān)鍵是二抗僅對(duì)檢測(cè)一抗（而不是捕獲抗體）具有特異性，或者該檢測(cè)對(duì)抗原不具有特異性。通常，通過(guò)使用來(lái)自不同宿主的捕獲抗體和一抗（例如分裂來(lái)自小鼠 IgG 和兔 IgG）可實(shí)現(xiàn)這一目的。對(duì)于夾心法檢測(cè)，使用已經(jīng)交叉吸附的二抗有利于清除任何可能對(duì)捕獲抗體有親和力的二抗。

直接，間接和夾心 ELISA 檢測(cè)方法的比較

直接ELISA檢測(cè)方法優(yōu)勢(shì)：

1. 速度快，因?yàn)橹挥幸环N抗體，且所用步驟更少。

2. 消除了二抗的交叉反應(yīng)。

直接ELISA檢測(cè)方法缺點(diǎn)：

1. 使用酶或標(biāo)簽進(jìn)行標(biāo)記可能會(huì)對(duì)一抗的免疫反應(yīng)性造成不利影響。

2. 為每個(gè)特異性 ELISA 系統(tǒng)標(biāo)記一抗既耗時(shí)且成本高昂。

3. 市售偶聯(lián)一抗的數(shù)量有限。

4. 從一個(gè)實(shí)驗(yàn)到另一個(gè)實(shí)驗(yàn)，不能靈活選擇一抗標(biāo)記。

5. 極低限度的信號(hào)放大。

間接ELISA檢測(cè)方法優(yōu)勢(shì)：

1. 有多種商用標(biāo)記二抗可用。

2. 功能多樣，因?yàn)楹芏嘁豢乖谝粋€(gè)物種內(nèi)就能完成，相同的標(biāo)記二抗可用于檢測(cè)。

3. 保留一抗的免疫反應(yīng)性，因其未標(biāo)記。

4. 靈敏度提高，因?yàn)槊總€(gè)一抗包含多個(gè)抗原決定簇，可以通過(guò)標(biāo)記二抗進(jìn)行結(jié)合，實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大。

5. 不同的檢測(cè)方法可搭配相同的一抗 (比色法，化學(xué)發(fā)光法等) 使用。

間接ELISA檢測(cè)方法缺點(diǎn)：

1. 可能與二抗發(fā)生交叉反應(yīng)，產(chǎn)生非特異性信號(hào)。

2. 在該程序中需要額外的孵育步驟。

夾心ELISA檢測(cè)方法優(yōu)勢(shì)：

1. 對(duì)靶抗原具有高靈敏度和高特異性，因?yàn)閮煞N抗體用于捕獲和檢測(cè)。

2. 相同的捕獲抗體可以使用不同的檢測(cè)方法。

間接ELISA檢測(cè)方法缺點(diǎn)：

需要更多優(yōu)化來(lái)鑒定抗體對(duì)，并確保捕獲和檢測(cè)抗體之間的交叉反應(yīng)性有限。

競(jìng)爭(zhēng)性 ELISA 和其他方法

除了上述的標(biāo)準(zhǔn)直接和夾心法形式，還存在其他幾種 ELISA 形式：

競(jìng)爭(zhēng)性 ELISA 是在抗原較小或只有一個(gè)抗原決定簇或抗體結(jié)合位點(diǎn)時(shí)使用的一種策略。該方法的一個(gè)變化在于它包含標(biāo)記純化抗原而非抗體。來(lái)自樣品的未標(biāo)記抗原和標(biāo)記抗原為了與捕獲抗體相結(jié)合而競(jìng)爭(zhēng)。與單獨(dú)使用標(biāo)記抗原的檢測(cè)孔進(jìn)行比較，來(lái)自純化抗原的信號(hào)減少表示樣品中存在抗原。

競(jìng)爭(zhēng)性 ELISA 方法概述

在競(jìng)爭(zhēng)性 ELISA 中，也稱(chēng)為抑制 ELISA ，通過(guò)信號(hào)干擾檢測(cè)來(lái)測(cè)定靶抗原的濃度。樣品中的靶抗原可與標(biāo)記的參比或標(biāo)準(zhǔn)品競(jìng)爭(zhēng)，以便與固定在板上的有抗體結(jié)合。

ELISPOT（酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)）指的是對(duì)接種到由 PVDF 膜提供支持的微孔板微孔中的細(xì)胞所分泌的蛋白質(zhì)進(jìn)行類(lèi)似于 ELISA 的捕獲和測(cè)量。它屬于“夾心法”檢測(cè)，其中，蛋白質(zhì)是在局部被捕獲的，因其是平板接種細(xì)胞分泌的，并且檢測(cè)是使用沉淀底物進(jìn)行的。ELISPOT 與蛋白質(zhì)印跡法類(lèi)似，其結(jié)果是膜表面的斑點(diǎn)。

細(xì)胞內(nèi) ELISA 使用在標(biāo)準(zhǔn)微孔板內(nèi)通宵平板接種并培養(yǎng)的細(xì)胞來(lái)執(zhí)行。培養(yǎng)細(xì)胞被固定、透性化和封閉后，使用抗體檢測(cè)靶蛋白。這是直接檢測(cè)，不屬于夾心法檢測(cè)。二抗為熒光（適合使用熒光板讀數(shù)儀或顯微鏡進(jìn)行直接測(cè)量）或酶偶聯(lián)（適合平板讀數(shù)儀使用可溶性底物進(jìn)行檢測(cè)）抗體。

ELISA 幾乎總是使用96孔或384孔聚苯乙烯平板和溶液（即生物體液、培養(yǎng)基或細(xì)胞裂解液）中的樣品來(lái)執(zhí)行。本文章剩余部分將討論該平臺(tái)。

ELISA 板

為特異性抗原開(kāi)發(fā) ELISA 時(shí)，第一步是為抗原或捕獲抗體優(yōu)化平板包被條件。首先選擇檢測(cè)微孔板（不是經(jīng)過(guò)組織培養(yǎng)處理的平板），蛋白結(jié)合力為400 ng/cm2。同樣重要的是，蛋白質(zhì)結(jié)合的 CV 值（變異系數(shù)）應(yīng)較低（ <5%），以便本應(yīng)相同的微孔和平板間檢測(cè)結(jié)果中的數(shù)值的偏差有限。平板顏色的選擇取決于要檢測(cè)的信號(hào)。透明聚苯乙烯平底反應(yīng)板用于比色信號(hào)，而黑色或白色不透明反應(yīng)板用于熒光和化學(xué)發(fā)光信號(hào)。使用前目測(cè)檢查反應(yīng)板塑料是否有瑕疵或劃損，否則從開(kāi)發(fā)的檢測(cè)采集數(shù)據(jù)時(shí)會(huì)引起畸變。Thermo Scientific 未包被 ELISA 反應(yīng)板提供多種表面，以使用您的大分子優(yōu)化包被。這些反應(yīng)板旨在得出最佳結(jié)果，實(shí)現(xiàn)批次間的可靠性和各孔之間的可重復(fù)性。

通過(guò)將蛋白質(zhì)被動(dòng)吸附到檢測(cè)微孔板的塑料上，實(shí)現(xiàn)平板包被。該過(guò)程是通過(guò)塑料和非極性蛋白質(zhì)殘基之間的疏水作用來(lái)完成的。盡管個(gè)別蛋白質(zhì)需要特定條件或預(yù)處理來(lái)優(yōu)化結(jié)合，包被平板最常見(jiàn)的方法包含添加 2-10 μg/ml 蛋白質(zhì)溶于堿性緩沖液（比如磷酸鹽緩沖鹽水（pH 值 7.4）或碳酸鹽-重碳酸鹽緩沖液（pH 值 9.4））后的溶液。讓平板在 4-37° C 條件下培養(yǎng)數(shù)小時(shí)至通宵。通常，在清除包被溶液后，添加封閉緩沖液以確保覆蓋塑料孔所有剩余可用的結(jié)合表面（參見(jiàn)后續(xù)討論）。包被平板可以立即使用，或者干燥后儲(chǔ)存在 4° C 條件下供以后使用，視包被蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性而定。

請(qǐng)務(wù)必注意，最佳包被條件和平板結(jié)合力因每種蛋白質(zhì)而異，必須通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定。除了競(jìng)爭(zhēng) ELISA 以外，包被平板的捕獲蛋白數(shù)量超過(guò)檢測(cè)過(guò)程中實(shí)際可結(jié)合數(shù)量，是為了促進(jìn)檢測(cè)實(shí)現(xiàn)可能最大的工作范圍。一些蛋白質(zhì)，尤其是抗體，在平板上實(shí)現(xiàn)最佳包被時(shí)的濃度低于其最大結(jié)合力，是為了防止非特異性蛋白在隨后的步驟中出現(xiàn)稱(chēng)為“鉤狀效應(yīng)”的現(xiàn)象。蛋白質(zhì)被困在包被蛋白之間產(chǎn)生鉤狀效應(yīng)，妨礙了有效清洗和清除未結(jié)合的蛋白。當(dāng)鉤狀物非特異性捕獲一抗和二抗的檢測(cè)時(shí)，會(huì)產(chǎn)生高背景信號(hào)，從而降低檢測(cè)的信噪比和靈敏度。

預(yù)包被 ELISA 孔板

對(duì)于抗體和蛋白質(zhì)，通過(guò)被動(dòng)吸附來(lái)包被平板通常效果良好。但是被動(dòng)吸附也可能引起問(wèn)題，包括定位不當(dāng)、變性、固定化效率低下以及污染物和靶分子結(jié)合不良。多種類(lèi)型的預(yù)包被板可幫助緩解這些問(wèn)題。預(yù)包被 蛋白 A ， G 或 A/G 的板有助于正確捕獲抗體并保持抗原結(jié)合能力。使用谷胱甘肽、金屬螯合物或捕獲蛋白包被的平板可以將融合蛋白沿正確方向連接到微孔板上。 肽和其他小分子，通常通過(guò)被動(dòng)吸附無(wú)法有效結(jié)合，可以進(jìn)行生物素化并高效連接到鏈霉抗生物素蛋白或 NeutrAvidin 蛋白包被平板上。生物素化抗體還可以固定到預(yù)包被生物素結(jié)合蛋白的平板上。以這種方式使用預(yù)包被平板，可以從平板表面物理分離抗原或捕獲抗體，作為應(yīng)對(duì)其變性作用的保護(hù)措施。聚合物涂層和經(jīng)修飾的表面可用于幫助增加被動(dòng)吸附。高性能表面包被平板（預(yù)包被和預(yù)封閉）提供96孔和384孔形式（黑色、透明或白色）的廣泛選擇。這些包被的微孔板可用于 ELISA 開(kāi)發(fā)和其他基于微孔板的檢測(cè)，使用光吸收、熒光或化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)。

ELISA 用不同類(lèi)型的微孔板

圖2. ELISA 用不同類(lèi)型的微孔板

以下示例舉例說(shuō)明了聚合物包被的變化如何影響蛋白質(zhì)結(jié)合力。

圖3.改性表面上的 IgG 結(jié)合。引入官能團(tuán)將影響塑料聚合物的結(jié)合特性。本實(shí)驗(yàn)表明表面改性將影響蛋白質(zhì)的結(jié)合。各種蛋白質(zhì)在未處理對(duì)照、Thermo Scientific Nunc MultiSorp（非常親水表面）和 MaxiSorp（親水表面）平底板上的吸附比較表明表面選擇對(duì)分析優(yōu)化的重要性。各種分子的表現(xiàn)截然不同，取決于表面的特性。例如，在堿性條件下，IgG 將吸附到 MaxiSorp 改性聚苯乙烯上，與未經(jīng)處理的對(duì)照平板相比，其容量顯著更大。如果是 MultiSorp，表面上的官能團(tuán)限制了蛋白質(zhì)吸附 IgG；結(jié)合力與未經(jīng)處理的平板相比，可明顯看出這一點(diǎn)。

ELISA 的一抗

單克隆或多克隆抗體可用作夾心 ELISA 和其他 ELISA 系統(tǒng)中的捕獲和檢測(cè)抗體。單克隆抗體對(duì)單個(gè)抗原決定簇具有固有的單特異性，可對(duì)抗原內(nèi)的細(xì)微差異進(jìn)行精細(xì)檢測(cè)和定量。多克隆抗體通常用作捕獲抗體，用于沉降盡可能多的抗原。然后單克隆抗體用作夾心法檢測(cè)中的檢測(cè)抗體，用于改善特異性。除了使用傳統(tǒng)單克隆抗體，重組單克隆抗體也可以用于 ELISA。例如，Invitrogen 兔重組抗體來(lái)自于產(chǎn)生抗體的細(xì)胞系，該細(xì)胞系采用工程技術(shù)后可表達(dá)特異性抗體重鏈和輕鏈 DNA 序列。與源自雜交瘤的傳統(tǒng)單克隆抗體相比，重組抗體不易發(fā)生細(xì)胞系漂移或批次間變化，因此可實(shí)現(xiàn)峰值抗原特異性。

設(shè)計(jì)夾心法 ELISA 的一個(gè)重要考慮因素是捕獲抗體和檢測(cè)抗體必須識(shí)別兩種不同的不重疊的抗原決定簇?？乖c捕獲抗體相結(jié)合時(shí)，不得掩蓋或改變檢測(cè)抗體識(shí)別的抗原決定簇。彼此互不干擾且可同時(shí)結(jié)合的捕獲抗體和檢測(cè)抗體被稱(chēng)之為“匹配對(duì)”，且適用于開(kāi)發(fā)夾心法 ELISA。很多一抗供應(yīng)商提供關(guān)于抗原決定簇的信息，并指出已在 ELISA 中經(jīng)過(guò)校驗(yàn)可作為匹配對(duì)的抗體對(duì)。使用相同的抗體進(jìn)行捕獲和檢測(cè)會(huì)限制最終 ELISA 的動(dòng)態(tài)范圍和靈敏度。

ELISA封閉緩沖液和洗滌緩沖液

微孔板孔的結(jié)合力通常高于每個(gè)孔中包被的蛋白質(zhì)數(shù)量。剩余表面積必須封閉，防止抗體或其他蛋白質(zhì)在后續(xù)步驟中吸附到平板上。封閉緩沖液是由無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)混合物或被動(dòng)吸附到平板所有剩余結(jié)合表面的其他化合物組成的溶液。如果通過(guò)減少背景信號(hào)并提高信噪比可改善檢測(cè)靈敏度，則封閉緩沖液有效。理想的封閉緩沖液將結(jié)合到發(fā)生非特異性相互作用的所有可能位點(diǎn)，消除背景，而未改變或掩蓋抗原決定簇進(jìn)行抗體結(jié)合。

開(kāi)發(fā)任何新的 ELISA 時(shí)，請(qǐng)務(wù)必在檢測(cè)中針對(duì)最高信噪比測(cè)試幾種不同的封閉劑。很多因素會(huì)影響非特異性結(jié)合，包括有關(guān)樣品和抗體的各種蛋白質(zhì)間相互作用。選擇封閉劑時(shí)的最重要參數(shù)是信噪比，它是使用包含目標(biāo)分析物的樣品獲得的信號(hào)與使用不含目標(biāo)分析物的樣品獲得的信號(hào)進(jìn)行比較后得出的測(cè)量結(jié)果。使用數(shù)量不足的封閉劑將導(dǎo)致背景過(guò)度和信噪比下降。使用過(guò)高濃度的封閉劑可能掩蓋抗體-抗原相互作用或者抑制酶作用，再次引起信噪比下降。不存在適合每種情況的封閉劑，實(shí)證檢驗(yàn)對(duì)于實(shí)現(xiàn)封閉步驟的真正優(yōu)化至關(guān)重要。

除了封閉之外，重要的是在 ELISA 每個(gè)步驟之間執(zhí)行清洗。清洗不充分可能造成高背景，同時(shí)，過(guò)度清洗可能因從孔微孔中洗脫抗體和/或抗原導(dǎo)致靈敏度下降。清洗在生理緩沖液中執(zhí)行，比如不含任何添加劑的 Tris-緩沖生理鹽水（TBS）或磷酸鹽緩沖生理鹽水（PBS）。通常，在緩沖液中加入洗滌劑，比如 0.05% 的吐溫20，有助于移除非特異性結(jié)合的材料。另一種常見(jiàn)的技術(shù)是使用封閉緩沖液的稀釋溶液并加入一些洗滌劑。清洗緩沖液含有封閉劑并加入洗滌劑有助于將檢測(cè)中的背景降。為了獲得最佳結(jié)果，請(qǐng)使用高純度洗滌劑，防止引入雜質(zhì)，以免干擾檢測(cè)此類(lèi)酶抑制劑或過(guò)氧化物。

ELISA 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法

圖4. ELISA 檢測(cè)方式

ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)步驟是所有 ELISA 系統(tǒng)中的最終階段。除非使用放射或熒光標(biāo)記，該步驟包含引入酶底物。酶將底物轉(zhuǎn)化為可檢測(cè)的產(chǎn)物。如果 ELISA 已妥善構(gòu)建和開(kāi)發(fā)，則添加底物時(shí)產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度與平板中捕獲并與檢測(cè)試劑結(jié)合的抗原數(shù)量成正比。酶偶聯(lián)抗體（尤其是包含辣根過(guò)氧化物酶（HRP）的抗體）為 ELISA 提供了最大的檢測(cè)靈活性和成像方法），因?yàn)榭捎糜陲@色、化學(xué)熒光和化學(xué)發(fā)光成像的底物豐富多樣。

比色底物形成一種可溶性有色產(chǎn)物，隨著時(shí)間的推移，該產(chǎn)物會(huì)與每個(gè)孔中存在的酶量成比例。當(dāng)達(dá)到所需的顏色強(qiáng)度時(shí)，可以直接測(cè)量產(chǎn)品吸光度，也可以在某些情況下添加終止液，以提供固定的終點(diǎn)檢測(cè)。比色底物可用于辣根過(guò)氧化物酶 (TMB ， OPD ， ABTS) 和堿性磷酸酶 (PNPP)。盡管不像熒光或化學(xué)發(fā)光底物那么靈敏，ELISA 顯色底物也可實(shí)現(xiàn)直接顯像并執(zhí)行動(dòng)力學(xué)研究。另外，使用標(biāo)準(zhǔn)吸光度板讀數(shù)儀檢測(cè) ELISA 顯色底物也是很多實(shí)驗(yàn)室的常見(jiàn)做法。

圖5. HRP 不同 TMB 比色 ELISA 底物靈敏度的比較。TMB（3,3'，5,5'-四甲基聯(lián)苯胺）是 HRP 的常見(jiàn)顯色底物，氧化后產(chǎn)生藍(lán)色。然后，加入硫酸或磷酸（常用用于終止反應(yīng)的溶液）后，顏色變?yōu)辄S色。在左圖中，比較了多種 TMB 底物在 ELISA 板測(cè)定中的性能。

化學(xué)發(fā)光是一種化學(xué)反應(yīng)，會(huì)產(chǎn)生光釋放的能量。大多數(shù)化學(xué)發(fā)光底物依賴(lài) HRP ，但某些 AP 同等產(chǎn)品可供選擇。方法是在存在 HRP 和過(guò)氧化物緩沖液的情況下使用魯米諾。魯米諾被氧化，形成了一種激發(fā)狀態(tài)的產(chǎn)品，隨著光線衰減到地面狀態(tài)而發(fā)出光線。只有酶底物反應(yīng)時(shí)才會(huì)發(fā)生光發(fā)射，因此當(dāng)?shù)孜镒優(yōu)楹谋M時(shí)，信號(hào)停止?；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)通常比比比色檢測(cè)更靈敏。將化學(xué)發(fā)光底物用于 ELISA 的一個(gè)缺點(diǎn)是信號(hào)強(qiáng)度比其他底物變化大。對(duì)于需要讀取很多平板的檢測(cè)，如果在平板讀數(shù)之前信號(hào)開(kāi)始衰減，就會(huì)出現(xiàn)問(wèn)題。為此，請(qǐng)務(wù)必確保檢測(cè)已使用該底物進(jìn)行優(yōu)化，避免將樣品內(nèi)的信號(hào)衰落誤判為低抗原豐度。HRP 的化學(xué)發(fā)光底物包括 Thermo Scientific SuperSignal ELISA Pico 和 ELISA Femto 底物。

熒光 ELISA 底物不那么常用，并且需要熒光計(jì)產(chǎn)生正確激發(fā)光束，以引起熒光標(biāo)記生成信號(hào)發(fā)射?；瘜W(xué)熒光檢測(cè)也是基于酶的，但生成的產(chǎn)品是熒光而非比色的。使用具有適當(dāng)激發(fā)和發(fā)射濾光片的熒光計(jì)測(cè)量信號(hào)。在動(dòng)力學(xué)分析中可以隨時(shí)間測(cè)量化學(xué)熒光反應(yīng)，也可以使用終止液直接測(cè)量。HRP 的化學(xué)熒光底物示例包括 Thermo Scientific QuantaRed 和 QuantaBlu 底物。

整套即用型 ELISA KIT試劑盒

除了本文章剩余部分討論的個(gè)別組分和 ELISA 一般原則，即用型夾心法 ELISA 試劑盒在商業(yè)上已可用于檢測(cè)作為共同研究目標(biāo)的數(shù)百鐘特異性細(xì)胞因子、神經(jīng)生物學(xué)分析物和磷酸化蛋白質(zhì)。

為很多靶標(biāo)提供兩種試劑盒類(lèi)型：

ELISA 試劑盒包含預(yù)包被抗體反應(yīng)板、檢測(cè)抗體、緩沖液、稀釋液、標(biāo)準(zhǔn)品和底物。除了傳統(tǒng)的 ELISA 試劑盒之外，還可提供即時(shí) ELISA 試劑盒板，其中包含所有必要成分，包括捕獲抗體和凍干檢測(cè)抗體，鏈霉親和素 -HRP 和樣品稀釋劑。此外，可單獨(dú)提供包含標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)品的聯(lián)排孔，以便使用 96 孔進(jìn)行檢測(cè)樣品。

圖6.一步法 ELISA 技術(shù)與傳統(tǒng) ELISA 程序的比較。與傳統(tǒng) ELISA 試劑盒相比，生產(chǎn)的 Thermo Scientific Invitrogen 一步法 ELISA 試劑盒包含開(kāi)發(fā) ELISA 所需的捕獲抗體和凍干檢測(cè)抗體及其他試劑。

· 未包被 ELISA 試劑盒—這些試劑盒配有包被自己平板所需的所有試劑，以及除終止液和洗滌緩沖液外運(yùn)行檢測(cè)。

· 抗體對(duì)試劑盒—這些試劑盒含有經(jīng)過(guò)優(yōu)化的匹配抗體，適合夾心 ELISA 開(kāi)發(fā)和標(biāo)準(zhǔn)品 (無(wú)板或檢測(cè)試劑)。

本 ELISA 方法選擇指南比較了 Thermo Fisher Invitrogen 抗體對(duì)試劑盒與 ELISA 試劑盒的特性。

圖7. Thermo Fisher Invitrogen 抗體對(duì)試劑盒與 ELISA 試劑盒的特性

*每項(xiàng)檢測(cè)都有其具體參數(shù)。請(qǐng)根據(jù)您具體的免疫分析/試劑盒查閱實(shí)驗(yàn)方案。

賽默飛提供ELISA檢測(cè)試劑等產(chǎn)品，請(qǐng)?jiān)L問(wèn)了解產(chǎn)品信息。

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