一、背景

成骨細(xì)胞分化培養(yǎng)基是專門為正常人類成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)設(shè)計的其生長的培養(yǎng)基。是經(jīng)滅菌的液體培養(yǎng)基，包含必需和非必需氨基酸、維生素、有機(jī)和無機(jī)化合物、激素、生長因子、微量礦物質(zhì)和低濃度胎牛血清(5%)。該培養(yǎng)基緩沖體系為重碳酸鹽，在含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中平衡后pH值為7.4。該培養(yǎng)基的配方能夠選擇性的促進(jìn)正常人類微血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)中的增殖和生長，并為其達(dá)到營養(yǎng)平衡狀態(tài)。

成骨細(xì)胞(osteoblast，OB)主要由內(nèi)外骨膜和骨髓中基質(zhì)內(nèi)的間充質(zhì)始祖細(xì)胞分化而來，能特異性分泌多種生物活性物質(zhì)，調(diào)節(jié)并影響骨的形成和重建過程。

在不同成熟時期，成骨細(xì)胞在體內(nèi)表現(xiàn)為4種不同形態(tài)，即前成骨細(xì)胞(preosteoblast)、成骨細(xì)胞(osteoblast)、骨細(xì)胞(osteocyte)和隊形細(xì)胞(bonesliningcell)。前成骨細(xì)胞是成骨細(xì)胞的前體，由基質(zhì)干細(xì)胞分化，沿著成骨細(xì)胞譜系發(fā)育而成，位于覆蓋骨形成表面的成骨細(xì)胞的外側(cè)。成熟的成骨細(xì)胞是位于骨表面的單層細(xì)胞，承擔(dān)著合成骨基質(zhì)的重要功能。

骨細(xì)胞是在成骨細(xì)胞系譜中成熟和的分化細(xì)胞。骨細(xì)胞包埋于礦化骨組織中，淺表骨細(xì)胞仍然保留部分成骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)。隊形細(xì)胞是排列于成體大部分骨表面的一層形態(tài)扁平或呈長方形的細(xì)胞。活躍的成骨細(xì)胞為梭形、錐形或立方形，胞漿嗜堿性。細(xì)胞核位于細(xì)胞的一端，核仁明顯，表面有短的突起與相鄰細(xì)胞連接。電鏡下胞漿內(nèi)具有典型的蛋白合成結(jié)構(gòu)——豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及核糖體，高爾基體較發(fā)達(dá)。

二、應(yīng)用

成骨細(xì)胞分化培養(yǎng)基可以用于MKRN1通過增強(qiáng)PPARγ泛素化降解促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化的研究：

探索E3泛素連接酶MKRN1在MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化過程中的作用,為骨質(zhì)疏松類疾病的治療提供新的方案和依據(jù)。

研究方法：

1、MKRN1對MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化的影響RT-qPCR和Western Blot檢測MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化過程中MKRN1 mRNA和蛋白表達(dá)量與時間的相關(guān)性。構(gòu)建腺病毒載體感染MC3T3-E1細(xì)胞過表達(dá)或敲低MKRN1,成骨分化誘導(dǎo)后檢測ALP活性;RT-qPCR、Western Blot檢測Runx2、Co L1A1、OCN的表達(dá)水平;茜素紅染色檢測礦化結(jié)節(jié)形成情況。

2、MKRN1和PPARγ共同作用對MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化的影響腺病毒載體感染MC3T3-E1細(xì)胞,敲低MKRN1與PPARγ的表達(dá)后誘導(dǎo)細(xì)胞成骨分化,檢測ALP活性;RT-qPCR、Western Blot檢測Runx2、Co L1A1、OCN的表達(dá)水平;茜素紅染色檢測礦化結(jié)節(jié)形成情況。

3、MKRN1對MC3T3-E1細(xì)胞中PPARγ表達(dá)的影響Western Blot檢測過表達(dá)或敲低MKRN1對細(xì)胞內(nèi)PPARγ蛋白表達(dá)水平的影響;Co-IP檢測MC3T3-E1細(xì)胞內(nèi)源性MKRN1和PPARγ結(jié)合情況;Co-IP檢測過表達(dá)MKRN1后細(xì)胞內(nèi)PPARγ蛋白的泛素化水平;Western Blot檢測添加MG132后,過表達(dá)MKRN1對于細(xì)胞內(nèi)PPARγ表達(dá)情況的影響。

結(jié)果：

1、MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化過程中,MKRN1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平隨著分化時間延長而升高;腺病毒載體能夠穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MC3T3-E1細(xì)胞,實現(xiàn)MKRN1過表達(dá)或敲低;敲低MKRN1表達(dá)后,與空白對照組和陰性轉(zhuǎn)染組相比較,ALP活性,Runx2、COL1A1和OCN mRNA和蛋白的表達(dá)均顯著降低,礦化結(jié)節(jié)形成減少(P<0.05);MKRN1過表達(dá)的MC3T3-E1細(xì)胞ALP活性,Runx2、COL1A1和OCN mRNA及蛋白表達(dá)量及礦化結(jié)節(jié)形成均高于空白對照組和空載轉(zhuǎn)染組(P<0.05)。

2、腺病毒載體能夠穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MC3T3-E1細(xì)胞,干擾PPARγ的表達(dá);干擾MC3T3-E1細(xì)胞中PPARγ的表達(dá),可以逆轉(zhuǎn)MKRN1敲低后對細(xì)胞成骨分化和礦化功能的抑制作用。

3、MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化顯著降低PPARγ蛋白表達(dá)水平;敲低MKRN1表達(dá)后PPARγ蛋白表達(dá)水平升高,而過表達(dá)MKRN1降低了PPARγ蛋白表達(dá)(P<0.01);Co-IP證實了內(nèi)源性MKRN1和PPARγ在細(xì)胞中具有相互作用;MKRN1過表達(dá)提高了PPARγ的泛素化水平;加入MG132逆轉(zhuǎn)了過表達(dá)MKRN1對PPARγ表達(dá)的抑制作用。

結(jié)論：

1、E3泛素連接酶MKRN1促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的成骨向分化。

2、在MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化過程中,MKRN1通過增強(qiáng)PPARγ泛素化降解發(fā)揮功能。

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