Class I PI3Ks activate stretch-induced autophagy in trabecular meshwork cells

Keywords: Autophagy; Glaucoma; Mechanical stress; PI3K; Primary cilia; Trabecular meshwork.

眼壓升高（IOP）是青光眼的主要危險因素，其是由于房水（AH）通過小梁網(wǎng)（TM）/施萊姆管（SC）流出通道組織的引流障礙，導致眼壓穩(wěn)態(tài)中斷。流出通道中的細胞持續(xù)受到機械力的影響，如拉伸應力和剪切應力，分別是由 IOP 和 AH 流量的每日波動引起。研究表明，TM 和 SC 細胞能夠通過各種生理反應感知和響應這些機械應力，這被認為是維持 IOP 穩(wěn)態(tài)所必需的內(nèi)在適應機制。

自噬的激活是一種適應性反應，初級纖毛（PC）是拉伸和剪切應力誘導的 TM 和 SC 細胞中自噬的關鍵機械傳感器。初級纖毛作為細胞的信號樞紐，參與多種細胞內(nèi)信號轉導通路。研究發(fā)現(xiàn)，PC 依賴性拉伸誘導的自噬是由人 TM（HTM）細胞中 AKT 和 SMAD2/3 信號之間的一種新型相互激活機制介導的。然而，上游信號轉導組件仍然難以捉摸。

磷酸磷脂酰肌醇（PIPs）是在真核細胞膜中發(fā)現(xiàn)的必需磷脂，是各種細胞過程中膜蛋白的關鍵調(diào)節(jié)因子，包括自噬。PIPs 由磷脂酰肌醇（PI）的第3、第4 和第5  位磷酸化產(chǎn)生，有7 種不同的 PIPs 衍生物。在第三位磷酸化的 PIPs  [PI（3）P、PI（3,5）P2 和 PI（3,4,5）P3] 參與自噬誘導和吞噬泡的形成。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3Ks）是一種可使PI環(huán)上第3 位羥基磷酸化的磷脂酰肌醇激酶，其結構可分為3 種類型（I 類、II 類和 III 類）。研究表明，I 類 PI3K 調(diào)節(jié) AKT 和 SMAD2/3 信號，并促進剪切應力誘導的 SC 細胞自噬。

最近，在美國杜克大學眼科中心及斯坦福大學醫(yī)學院眼科團隊的一項研究中，探索了 PI3Ks 和 PIPs 作為上游信號成分在機械拉伸的 HTM 細胞中 PC 依賴性自噬激活中的作用，研究報道了 PIK3CA-INPP4A/B 參與機械應力下的自噬激活以及 PIK3CA 在 PC 上的定位。研究成果發(fā)表于 Cellular and Molecular Life Sciences  期刊題為“Class I PI3Ks activate stretch-induced autophagy in trabecular meshwork cells”。

為了研究 I 類 PI3Ks 是否構成響應機械拉伸 TM 細胞中介導自噬激活的上游成分，首先分析了 PI3K 家族所有不同成員的催化亞基的 mRNA 表達水平。利用針對流出通道的單細胞 RNA 測序數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn) TM 細胞中 PI3Ks 催化亞基的 5 種亞型在 mRNA 水平上顯著表達：IA 類 [PIK3CA（11.82%）、B（5.76%）和 D （3.75%）]、II 類 [PIK3C2A（18.59%）] 和 III 類 [PIK3C3（14.27%）]。

使用 PIK-75 對 I 類 PI3Ks 進行藥理學抑制，濃度遞增的 PIK-75（20 nM-2 μM）處理 HTM 細胞，隨后應用循環(huán)機械拉伸（CMS，20% 或 8%應變，1 Hz）。2 μM 的 PIK-75 處理降低了 CMS 誘導的 LC3 II 水平升高（圖1 A）。

最近一項關于造血干細胞的研究表明，PIK3CA、B 和 D 一起缺失，而不是單獨或成對缺失，會破壞自噬。為了研究這種可能性，使用針對 PIK3CA、B 和 D 的 siRNA 對 IA 類 PI3Ks 的催化亞基進行單次或三次敲低，并評估機械拉伸細胞中的 LC3 II 水平。WB 分析顯示，與對照細胞相比，經(jīng)三重敲低的細胞中 CMS 誘導的 LC3 II 顯著降低（圖1 B）。與先前在造血干細胞中的發(fā)現(xiàn)一致，每個基因的單次敲除并不能阻止CMS誘導的LC3 II水平增加。

進一步研究證實，在用表達 RFP-GFP-LC3（Ad-tfLC3）的腺病毒轉導的 HTM 細胞中抑制 I 類 PI3Ks 可防止 CMS 誘導的自噬體形成。與之前的研究一致，在 2 μM PIK-75 處理的CMS 刺激細胞中觀察到自噬數(shù)據(jù)（自噬體：黃色點；自噬溶酶體：紅色點）有質的增加（圖1 C）。這些發(fā)現(xiàn)表明，I 類 PI3K 催化亞基通過促進自噬體的形成在調(diào)節(jié) CMS 誘導的自噬中發(fā)揮作用。

圖1     抑制 IA 類 PI3Ks 可防止 CMS 誘導的 HTM 細胞自噬。

接下來，研究了 II 類和 III 類 PI3K 是否也有助于 TM 細胞中拉伸誘導的自噬激活。為此，沉默了 HTM 細胞中 PIK3C2A 的表達，并評估了 CMS 后的 LC3 II 水平，發(fā)現(xiàn)PIK3C2A敲低并不能阻止CMS 作用下TM 細胞中 LC3 II 的增加。此外，III 類 PI3K（PIK3C3）的敲低并未抑制 CMS 誘導的 TM 細胞自噬激活。這些結果表明，II 類 PI3Ks 和 III 類 PI3Ks 均未顯著促進 TM 細胞中拉伸誘導的自噬激活。

進一步研究 I 類 PI3Ks 在 HTM 細胞中 PC 上的定位。研究人員專注于 IA 類 PI3Ks（PIK3CA、PIK3CB 和 PIK3D），因為它們是 TM 細胞中表達強烈的亞型。使用針對每種 I 類 PI3K 亞型的催化亞基的抗體以及乙?；?TUBA4A（Ac-TUBA4A（一種 PC 標志物）進行免疫共染色。結果顯示，PIK3CB 或 PIK3CD 在 PC 上沒有顯著的共定位。相比之下，PIK3CA 與 PC 表現(xiàn)出很強的共定位性（圖2 A）。有趣的是，在暴露于循環(huán)機械拉伸的細胞中，PC 上 PIK3CA 的強度水平顯著降低（圖2 B）。這些結果表明，PIK3CA 定位于 PC 上，并在 CMS 處理的 HTM 細胞中與 PC 解離。

圖2     PIK3CA 在 PC 上的定位及其在CMS 處理的 HTM 細胞中與 PC 的解離。

上述結果表明，I 類 PI3Ks 在 CMS 誘導的自噬中的作用。據(jù)報道，I 類 PI3Ks 與 PI 磷酸酶活性相結合，為 T 細胞中自噬的啟動提供 PI（3）P。因此，研究了由 I 類 PI3Ks 和 PI 磷酸酶產(chǎn)生的 PI（3）P 是否參與 CMS 誘導的 TM 細胞自噬。

首先，研究了 I 類 PI3Ks 參與 PC 的 PI（3）P 產(chǎn)生情況。為此，敲低所有三種 IA 類 PI3Ks（PIK3CA、PIK3CB 和 PIK3CD）的表達，并對 PI（3）P 和 PC 標志物 ARL13B 進行共免疫染色，發(fā)現(xiàn)在 PC 和胞質囊泡內(nèi)觀察到 PI（3）P 染色（圖3 A）。正如預期的那樣，I 類 PI3K 活性降低的細胞表現(xiàn)出 PI（3）P 染色的整體降低。定量分析證實，在 I 類 PI3K 敲低后，PC 處的 PI（3）P 水平顯著降低，支持 I 類 PI3Ks 在纖毛 PI（3）P 產(chǎn)生中的作用（圖3 B）。值得注意的是，在機械拉伸的細胞中未觀察到 PC 上 PI（3）P 產(chǎn)生的顯著差異。

圖3    PIK3CA、B 和 D 的三重敲低降低了 HTM 細胞中 PC 上 PI（3）P 的強度。

I 類 PI3Ks 主要產(chǎn)生 PI（3,4）P2 和 PIP3，然后轉化為 PI（3）P。PI（3,4）P2 和 PIP3 都與 AKT 的普列克底物蛋白同源（PH）結構域結合。為了檢測 PI（3,4）P2 或 PIP3，使用生物傳感器質粒AKT-PH-GFP 轉染 HTM 細胞并進行 CMS 處理。有趣的是，共聚焦顯微鏡顯示在質膜上檢測到 AKT-PH-GFP 信號，并在細胞內(nèi)囊泡中積累（圖4 A）。響應 CMS 后，每個細胞的 AKT-PH-GFP 陽性囊泡數(shù)量顯著增加（圖4 A）。共免疫染色進一步揭示了這些囊泡與網(wǎng)格蛋白重鏈（CLTC）的部分共定位（圖4 B），表明囊泡是通過網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞過程形成的。

最后，實驗旨在確定 I 類 PI3K（PIP3 或 PI（3,4）P2）產(chǎn)生的哪些 PIPs 轉化為 PI（3）P 以在 CMS 下啟動吞噬泡的形成，以及與之相關的磷酸酶。為此，使用 siRNA 對 SHIP1 和 SHIP2（介導 PIP3 轉化為 PI（3,4）P2的5’ PI 磷酸酶）或 INPP4A 和 INPP4B（介導 PI（3,4）P2 轉化為 PI（3）P的 4' PI 磷酸酶）進行了雙重敲低，并進行 CMS 測量 LC3 II 水平。結果顯示，敲低 INPP4A/B ，但不是 SHIP1/2，顯著降低了 TM 細胞中 CMS 誘導的 LC3 II 增加（圖4 C）。此外，使用 AS1949490 對 SHIP1/2 進行化學抑制，在濃度遞增的情況下，并沒有降低 CMS 誘導的 LC3 II 水平。共定位研究 AKT-PH-GFP 和 LC3 標記點之間的部分共定位或接觸，表明 I 類 PI3Ks 產(chǎn)生的 PIPs 可能有助于自噬體的生物發(fā)生。這些發(fā)現(xiàn)表明，I 類 PI3Ks 與 INPP4 磷酸酶一起在 CMS 誘導的TM 細胞自噬中起直接作用。

圖4     在 HTM 細胞 CMS 期間 PI（3,4）P2 陽性囊泡對自噬的調(diào)節(jié)。

總之，該研究描述了 PIK3CA-INPP4A/B 在機械應力下自噬激活中的作用以及 PIK3CA 在 PC 上的定位。未來需要進一步的研究來了解哪些 IA 類 PI3Ks 調(diào)節(jié)自噬降解的機制，以及通過機械力調(diào)節(jié) IA 類 PI3K 激活的上游信號。在 TM 機械感覺中具有已知功能的強候選者是整合素和 G 蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）。了解青光眼中的這些通路及其潛在改變，包括 I 類 PI3K 的改變，可以提供新的治療策略來恢復 IOP 穩(wěn)態(tài)。

參考文獻：Shim MS, Sim EJ, Betsch K, Desikan V, Su CC, Pastor-Valverde D, Sun Y, Liton PB. Class I PI3Ks activate stretch-induced autophagy in trabecular meshwork cells. Cell Mol Life Sci. 2025 Feb 22;82(1):82. doi: 10.1007/s00018-025-05615-x. PMID: 39985671; PMCID: PMC11846827.

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