羅氏LightCycler® 96 實時熒光定量PCR儀系統(tǒng)詳解

一、引言

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time quantitative PCR，qPCR）已成為基因表達(dá)分析、病原檢測、突變篩查等領(lǐng)域的重要工具。羅氏公司開發(fā)的LightCycler® 96 實時熒光定量PCR儀憑借其四通道檢測能力、靈活的實驗設(shè)置以及友好的軟件界面，在科研和臨床實驗室中得到廣泛應(yīng)用。本文將從儀器構(gòu)造、工作原理、技術(shù)特點、應(yīng)用場景、操作流程及維護(hù)要點等方面，系統(tǒng)介紹該設(shè)備的性能與使用方法。

二、設(shè)備概述

LightCycler® 96 是一款中通量的實時熒光定量PCR儀，可容納96孔標(biāo)準(zhǔn)板，適合日常分子生物學(xué)實驗的需求。該系統(tǒng)集成了溫控模塊、光學(xué)檢測系統(tǒng)、控制系統(tǒng)與數(shù)據(jù)分析平臺，能夠?qū)崿F(xiàn)快速、準(zhǔn)確的qPCR擴增與實時數(shù)據(jù)采集。

主要構(gòu)成包括：

• 溫控模塊：采用帕爾貼元件（Peltier-based system）進(jìn)行升降溫控制，溫度梯度小，確保各孔間的溫度均一性。

• 光學(xué)檢測系統(tǒng)：搭載四個熒光通道（常用為FAM、HEX、ROX、Cy5），配有獨立的激發(fā)與檢測光路，支持多重檢測。

• 操作界面：通過USB或局域網(wǎng)連接PC，配套LightCycler® 96軟件進(jìn)行程序設(shè)置與數(shù)據(jù)分析。

三、技術(shù)參數(shù)

四、工作原理

LightCycler® 96 的工作流程遵循標(biāo)準(zhǔn)的實時熒光PCR過程，其核心為：

1. 模板擴增：在熱循環(huán)條件下，由特異性引物、探針、酶等反應(yīng)組分合成目標(biāo)DNA。

2. 熒光監(jiān)測：熒光染料與擴增產(chǎn)物結(jié)合，熒光強度隨著擴增進(jìn)行而增強，系統(tǒng)實時記錄每個循環(huán)的熒光值。

3. Ct值計算：軟件自動識別熒光信號達(dá)到閾值時的循環(huán)數(shù)，生成Ct（Cycle threshold）值。

4. 定量分析：通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法或ΔΔCt法對未知樣品進(jìn)行相對或絕對定量。

五、關(guān)鍵特性與優(yōu)勢

1. 精準(zhǔn)的溫度控制

LightCycler® 96 的溫控模塊采用多點溫度傳感器和閉環(huán)控制算法，保障各孔間溫差控制在±0.2°C以內(nèi)。熱循環(huán)效率高，縮短實驗總耗時。

2. 多通道熒光檢測系統(tǒng)

四個熒光通道可同步采集不同染料信號，適合SYBR Green法和TaqMan探針法的單重或多重PCR實驗。每個通道設(shè)有獨立激發(fā)與發(fā)射濾光片，避免通道間信號干擾，提高檢測靈敏度和特異性。

3. 軟件智能化分析

LightCycler® 96配套軟件界面簡潔直觀，提供圖形化編程與數(shù)據(jù)分析功能，包括：

• 實時擴增曲線、熔解曲線圖

• Ct值自動計算

• 標(biāo)準(zhǔn)曲線生成與效率評估

• 多重擴增數(shù)據(jù)整合

此外，軟件支持批量數(shù)據(jù)導(dǎo)出，便于后續(xù)統(tǒng)計分析與報告撰寫。

4. 開放性實驗設(shè)置

支持用戶自定義擴增程序與檢測方案，適用于多種應(yīng)用需求?？蛇M(jìn)行末端熔解曲線分析，用于鑒定引物特異性與判斷非特異擴增產(chǎn)物。

六、典型應(yīng)用場景

1. 基因表達(dá)定量

通過反轉(zhuǎn)錄實時PCR（RT-qPCR）技術(shù)，研究目標(biāo)基因在不同處理組、時間點或組織中的表達(dá)差異。

2. 病原體檢測

快速檢測病毒、細(xì)菌、真菌等病原體DNA/RNA，包括新發(fā)傳染病的快速篩查（如新冠病毒、甲型流感等）。

3. 基因多態(tài)性與突變分析

結(jié)合TaqMan探針或熔解曲線分析技術(shù)，識別單核苷酸多態(tài)性（SNP）與點突變。

4. 拷貝數(shù)變異分析

適用于腫瘤基因擴增、拷貝數(shù)異常分析，輔助診斷與藥物靶點篩選。

七、操作流程簡述

1. 反應(yīng)體系配制：按實驗方案準(zhǔn)備引物、探針、酶等反應(yīng)組分，分裝于96孔板中。

2. 程序設(shè)置：在軟件中設(shè)定熱循環(huán)參數(shù)，包括初始變性、退火、延伸步驟及熒光采集通道。

3. 加載樣品：將PCR板封膜后置于儀器托盤內(nèi)。

4. 啟動實驗：點擊運行按鈕后，系統(tǒng)自動執(zhí)行熱循環(huán)并采集實時熒光信號。

5. 數(shù)據(jù)分析：實驗結(jié)束后，使用軟件生成擴增曲線、計算Ct值、進(jìn)行定量分析或熔解曲線判斷。

八、儀器維護(hù)與注意事項

為確保設(shè)備長期穩(wěn)定運行，應(yīng)定期進(jìn)行以下操作：

• 清潔光學(xué)模塊：用無塵布擦拭樣品托盤，避免熒光通道污染。

• 校準(zhǔn)溫控系統(tǒng)：使用標(biāo)準(zhǔn)板驗證溫控均一性，必要時進(jìn)行系統(tǒng)校準(zhǔn)。

• 軟件升級與備份：定期檢查軟件更新，導(dǎo)出重要實驗數(shù)據(jù)防止丟失。

• 防止冷凝水進(jìn)入儀器：實驗過程中避免樣品板冷凝水倒流。

九、發(fā)展趨勢與展望

隨著分子診斷技術(shù)的發(fā)展，實時PCR儀器正朝向多通道、高通量、小型化與自動化方向演進(jìn)。LightCycler® 96 在提供可靠數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，若結(jié)合自動加樣系統(tǒng)、生物信息分析平臺等，將更好地滿足精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)、環(huán)境監(jiān)測、食品安全等多場景應(yīng)用。

十、結(jié)語

羅氏LightCycler® 96 實時熒光定量PCR儀以其穩(wěn)定的性能、友好的軟件操作體驗以及多種兼容的實驗方案，為分子生物學(xué)實驗提供了可靠的技術(shù)平臺。盡管在通量和自動化程度上尚有拓展空間，但作為科研與教學(xué)實驗室的常規(guī)工具，其表現(xiàn)足以支撐日常分析任務(wù)。未來，結(jié)合上游核酸提取與下游數(shù)據(jù)解讀系統(tǒng)的整合，qPCR平臺的智能化水平有望進(jìn)一步提升。