2025 年 4 月 ，日本科學(xué)家佐藤俊朗教授團(tuán)隊(duì)在國(guó)際頂尖學(xué)術(shù)期刊 Nature 上發(fā)表研究論文。

Generation of human adult hepatocyte organoids with metaboli

該研究從直接取自人類患者的冷凍保存的成人肝細(xì)胞中培養(yǎng)出了具有代謝功能的成人肝細(xì)胞類器官。這些肝細(xì)胞類器官持續(xù)生長(zhǎng)了三個(gè)月，并且在半年內(nèi)仍保持分化能力。這些肝細(xì)胞類器官為肝臟移植/肝臟疾病治療提供了新的發(fā)展平臺(tái)。

步驟

操作細(xì)節(jié)

1. 肝細(xì)胞的獲取與準(zhǔn)備

從商業(yè)供應(yīng)商處購(gòu)買凍存的原代人肝細(xì)胞（PHHs），并使用 Cryopreserved Hepatocyte Recovery Medium 進(jìn)行復(fù)蘇。

2. 肝細(xì)胞的分選（可選）

使用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)肝細(xì)胞進(jìn)行分選，利用 APC 結(jié)合的小鼠抗人 EpCAM 抗體、PE 結(jié)合的小鼠抗 ASGPR 1 抗體和 DAPI 對(duì)肝細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，分選出 ASGPR1+EpCAM?的肝細(xì)胞。

3. 類器官培養(yǎng)

將 1000 個(gè) PHH 細(xì)胞嵌入 Matrigel 中，鋪在 48 孔板中，每孔覆蓋 300 μl 擴(kuò)張培養(yǎng)基，置于 37℃、5% CO?和 20% O?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4. 培養(yǎng)基的更換

每 2-3 天更換一次擴(kuò)張培養(yǎng)基，直至類器官形成并開(kāi)始擴(kuò)增。

5. 類器官的傳代

當(dāng)類器官生長(zhǎng)至一定大小后，使用 TrypLE Express 將其從 Matrigel 中解離，制成單細(xì)胞懸液，按 1:3 至 1:12 的比例進(jìn)行傳代。

6. 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

基于癌癥基因組數(shù)據(jù)，篩選出 WNT、RAS、TGFβ、STAT3 和 PKA 通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，設(shè)計(jì)包含 EGF、HGF 和 FGF-10（EHF）、Wnt/R-spondin、TGFβ 家族抑制劑（A83-01 和 Noggin）、IL-6 和 PKA 激活劑（forskolin）的擴(kuò)張培養(yǎng)基，以促進(jìn)類器官的長(zhǎng)期擴(kuò)增。

7. 類器官的純化

由于原代人肝細(xì)胞樣本中可能含有少量膽管細(xì)胞，需通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察手動(dòng)去除膽管類器官，以促進(jìn)肝細(xì)胞類器官的選擇性生長(zhǎng)。

8. OSM-STAT3 信號(hào)激活

在擴(kuò)張培養(yǎng)基中添加 Oncostatin M（OSM），激活 STAT3 信號(hào)，以促進(jìn)肝細(xì)胞類器官的擴(kuò)增并維持其肝臟特性。

9. 類器官的分化培養(yǎng)（可選）

將擴(kuò)增后的類器官（eHHOs）解離成單細(xì)胞，嵌入 Matrigel 中，預(yù)培養(yǎng) 7-14 天后，更換為分化培養(yǎng)基，再培養(yǎng) 10-14 天以獲得分化后的類器官（dHHOs）。

10. 差異化培養(yǎng)（可選）

從分化后的類器官中，通過(guò)添加 Wnt/R-spondin 可誘導(dǎo)形成中央靜脈標(biāo)志物表達(dá)的類器官（dHHO + WR）。

11. 肝臟特異性功能誘導(dǎo)（可選）

將分化后的類器官置于不含葡萄糖的培養(yǎng)基中饑餓培養(yǎng) 18 小時(shí)，以誘導(dǎo)門(mén)脈靜脈標(biāo)志物和部分中央靜脈標(biāo)志物基因的表達(dá)。

12. 基因編輯（可選）

使用電穿孔技術(shù)將單向?qū)?RNA（sgRNA）引入類器官中，結(jié)合 LATSi 和人類血小板裂解液，實(shí)現(xiàn)肝細(xì)胞類器官的基因編輯，構(gòu)建基因敲除模型。

(一)哪些亮點(diǎn)是原文獲得《Nature》錄用的主要原因？

1. 研究的創(chuàng)新性和突破性

解決領(lǐng)域內(nèi)關(guān)鍵難題：在細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，尤其是肝細(xì)胞研究方面，長(zhǎng)期以來(lái)存在的一個(gè)關(guān)鍵難題是如何在體外平衡人肝細(xì)胞的擴(kuò)增與功能維持。既往研究雖已取得一定進(jìn)展，但始終難以實(shí)現(xiàn)肝細(xì)胞的長(zhǎng)期自我更新并同時(shí)保持其功能活性。而該研究成功建立了具有代謝功能的人成肝細(xì)胞類器官新培養(yǎng)體系，實(shí)現(xiàn)了肝細(xì)胞的長(zhǎng)期擴(kuò)增和功能維持，為肝細(xì)胞生物學(xué)研究開(kāi)辟了新的途徑，這種創(chuàng)新性的突破是《Nature》極為重視的亮點(diǎn)之一，因?yàn)樗粌H解決了現(xiàn)有技術(shù)瓶頸，還為后續(xù)相關(guān)研究奠定了新基礎(chǔ)。

提出新方法和策略：該研究創(chuàng)新性地將癌癥基因組學(xué)與肝細(xì)胞培養(yǎng)相結(jié)合，通過(guò)分析肝細(xì)胞癌的基因圖譜，精準(zhǔn)鎖定關(guān)鍵的干細(xì)胞龕因素，如 Wnt/R-spondin、EGF 等，并以此為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)出的擴(kuò)增培養(yǎng)基和分化培養(yǎng)基，開(kāi)發(fā)出人成肝細(xì)胞類器官的優(yōu)化培養(yǎng)條件。這種方法的提出為肝細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域帶來(lái)了全新的視角和技術(shù)手段，也為其他類型細(xì)胞的培養(yǎng)提供了借鑒和思路，符合《Nature》對(duì)于研究方法創(chuàng)新性的要求。

2. 研究的重要性

對(duì)肝病研究的重大推動(dòng)作用：所生成的人肝細(xì)胞類器官在建模肝病方面展現(xiàn)出巨大潛力，如代謝性肝病、肝衰竭等疾病模型的構(gòu)建，為深入探究這些疾病的發(fā)病機(jī)制提供了有力工具。此外，它還為藥物代謝和毒理學(xué)研究搭建了理想的平臺(tái)，有助于加速新藥研發(fā)進(jìn)程，提高藥物篩選的準(zhǔn)確性和可靠性，從而對(duì)人類健康事業(yè)產(chǎn)生積極影響。《Nature》傾向于發(fā)表那些對(duì)科學(xué)領(lǐng)域具有廣泛影響和推動(dòng)作用的研究成果，而該研究在肝病研究和藥物研發(fā)方面的潛在價(jià)值使其具備了這一特征。

對(duì)再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的意義：該研究有望為肝臟再生醫(yī)學(xué)帶來(lái)新的突破。通過(guò)優(yōu)化人肝細(xì)胞類器官的培養(yǎng)體系，使其具備更好的功能和特性后，有望在未來(lái)的肝臟移植和組織修復(fù)等再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用，為解決肝臟供體短缺等問(wèn)題提供可能的解決方案，這進(jìn)一步凸顯了其研究的重要性。

3. 研究的交叉性和跨學(xué)科性

整合多學(xué)科知識(shí)和方法：該研究融合了細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳學(xué)和醫(yī)學(xué)等多學(xué)科領(lǐng)域的知識(shí)和方法，體現(xiàn)了跨學(xué)科研究的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)。例如，通過(guò)基因編輯技術(shù)對(duì)肝細(xì)胞類器官進(jìn)行基因敲除，創(chuàng)建疾病模型，這不僅需要細(xì)胞生物學(xué)方面的專業(yè)知識(shí)，還涉及到分子生物學(xué)中的基因操作技術(shù)和遺傳學(xué)原理。同時(shí)，研究結(jié)果在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用前景也體現(xiàn)了醫(yī)學(xué)與基礎(chǔ)科學(xué)研究的緊密結(jié)合?！禢ature》作為綜合性科學(xué)期刊，非常重視這種跨學(xué)科的研究，因?yàn)樗軌虼蚱茖W(xué)科界限，促進(jìn)不同領(lǐng)域之間的交流與合作，推動(dòng)科學(xué)的整體發(fā)展。

4. 研究的可讀性和影響力

清晰的研究思路和表達(dá)：文章在闡述研究過(guò)程和結(jié)果時(shí)邏輯清晰、條理分明，使得讀者能夠容易地理解研究的重點(diǎn)和意義。這對(duì)于一篇高質(zhì)量的科研論文來(lái)說(shuō)至關(guān)重要，因?yàn)樗軌虼_保研究成果能夠準(zhǔn)確、有效地傳達(dá)給廣大科研工作者和讀者群體，從而促進(jìn)科學(xué)知識(shí)的傳播和交流。

潛在的廣泛影響力：鑒于該研究在肝細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和疾病模型構(gòu)建方面的創(chuàng)新性和重要性，其研究成果有望在學(xué)術(shù)界和工業(yè)界引起廣泛關(guān)注，并激發(fā)大量后續(xù)研究和應(yīng)用。這不僅能夠提升該研究領(lǐng)域的整體研究水平，還可能對(duì)相關(guān)產(chǎn)業(yè)（如制藥業(yè)）產(chǎn)生積極的推動(dòng)作用，符合《Nature》發(fā)表能夠在科學(xué)界產(chǎn)生重要影響和作用的論文的宗旨。

（二）原文作者可能存在研究局限性

2.1 對(duì)OSM-STAT3激活的長(zhǎng)期穩(wěn)定性和安全性認(rèn)識(shí)不足：雖發(fā)現(xiàn)OSM-STAT3激活能促進(jìn)肝細(xì)胞增殖、抑制膽管化生并維持肝細(xì)胞特性，但其長(zhǎng)期穩(wěn)定性和安全性有待明確。長(zhǎng)期激活STAT3可能使肝細(xì)胞面臨轉(zhuǎn)化或致癌風(fēng)險(xiǎn)。

2.2 肝細(xì)胞類器官在體外的功能測(cè)試不夠完善：研究表明肝細(xì)胞類器官代謝功能與體內(nèi)肝細(xì)胞相當(dāng)，但體外功能測(cè)試可能存在局限性。例如，研究主要集中在肝細(xì)胞類器官在異體移植模型中的再群體效率及代謝區(qū)帶結(jié)構(gòu)重建，對(duì)于更復(fù)雜的體內(nèi)環(huán)境和疾病模型中的功能表現(xiàn)，還需深入探究。

2.3 培養(yǎng)體系的規(guī)?；蜆?biāo)準(zhǔn)化面臨挑戰(zhàn)：所描述培養(yǎng)體系在規(guī)?；蜆?biāo)準(zhǔn)化方面可能存在問(wèn)題。如原代肝細(xì)胞來(lái)源和質(zhì)量、培養(yǎng)基成分和制備、培養(yǎng)過(guò)程操作技術(shù)等因素會(huì)影響肝細(xì)胞類器官生成的重復(fù)性和穩(wěn)定性，建立標(biāo)準(zhǔn)化、可規(guī)?；囵B(yǎng)體系對(duì)廣泛應(yīng)用至關(guān)重要。

2.4 對(duì)個(gè)體差異和疾病異質(zhì)性考慮不足：研究可能未充分考慮個(gè)體差異和疾病異質(zhì)性。不同個(gè)體肝細(xì)胞功能和對(duì)刺激反應(yīng)存在差異，且肝細(xì)胞類器官培養(yǎng)體系和功能表征或難以涵蓋肝病多樣性，限制研究結(jié)果臨床應(yīng)用范圍。

（三）結(jié)合Kirkstall Quasi Vivo類器官3D灌流動(dòng)態(tài)構(gòu)建系統(tǒng)，對(duì)新的科研方向及預(yù)期成果展望

3.1提升肝細(xì)胞類器官功能和成熟度：Kirkstall Quasi Vivo 3D灌流動(dòng)態(tài)系統(tǒng)可為肝細(xì)胞類器官提供穩(wěn)定可控培養(yǎng)環(huán)境。調(diào)控流速、氧濃度、營(yíng)養(yǎng)供給等參數(shù)，能更精準(zhǔn)模擬體內(nèi)生理環(huán)境，促進(jìn)肝細(xì)胞類器官分化和成熟，提升其代謝、藥物代謝等功能，使其更接近體內(nèi)肝細(xì)胞水平。

3.2 構(gòu)建復(fù)雜肝臟疾病模型：利用Kirkstall Quasi Vivo類器官3D灌流動(dòng)態(tài)構(gòu)建系統(tǒng)將肝細(xì)胞類器官與其他肝細(xì)胞（如內(nèi)皮細(xì)胞、庫(kù)普弗細(xì)胞、星狀細(xì)胞等）結(jié)合，構(gòu)建復(fù)雜肝臟疾病模型?？裳芯扛卫w維化、肝硬化、肝癌等疾病中不同類型肝細(xì)胞相互作用及在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制，深入理解疾病發(fā)病機(jī)制，挖掘新治療靶點(diǎn)。

3.3 藥物篩選和毒性測(cè)試應(yīng)用：Kirkstall Quasi Vivo類器官3D灌流動(dòng)態(tài)構(gòu)建系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)培養(yǎng)環(huán)境有助于更準(zhǔn)確評(píng)估藥物對(duì)肝細(xì)胞類器官的影響。通過(guò)持續(xù)向培養(yǎng)系統(tǒng)中灌注藥物并實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)肝細(xì)胞類器官響應(yīng)變化，可更可靠全面地獲取藥物代謝、毒性和療效數(shù)據(jù)，提高藥物篩選和毒性測(cè)試準(zhǔn)確性和可靠性，減少動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依賴，加速新藥研發(fā)進(jìn)程。

3.4 個(gè)性化醫(yī)療研究：結(jié)合患者來(lái)源的肝細(xì)胞類器官與Kirkstall Quasi Vivo系統(tǒng)，可建立個(gè)性化肝臟疾病模型和藥物反應(yīng)預(yù)測(cè)平臺(tái)。這有助于為患者制定個(gè)性化治療方案，提高治療效果和安全性。例如，利用代謝性肝病患者的肝細(xì)胞類器官篩選和優(yōu)化藥物，依據(jù)患者遺傳背景和疾病特征實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)治療。

3.5 肝細(xì)胞類器官長(zhǎng)期培養(yǎng)和存儲(chǔ)：該系統(tǒng)有望延長(zhǎng)肝細(xì)胞類器官培養(yǎng)時(shí)間并解決長(zhǎng)期存儲(chǔ)難題。優(yōu)化培養(yǎng)條件和保存方法可長(zhǎng)期保持肝細(xì)胞類器官活性和功能，為研究和臨床應(yīng)用提供穩(wěn)定可靠肝細(xì)胞模型源。

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