Endothelial c-REL orchestrates atherosclerosis at regions of disturbed flow through crosstalk with TXNIP-p38 and non-canonical NF-κB pathways

KWS：c-REL, Shear stress, Endothelial, Atherosclerosis

動(dòng)脈粥樣硬化的特征是脂質(zhì)和炎癥物質(zhì)在動(dòng)脈壁內(nèi)的積累，其主要發(fā)生在血流紊亂的動(dòng)脈分支和彎曲處。這些血流動(dòng)力學(xué)條件誘導(dǎo)低壁剪切應(yīng)力（WSS），導(dǎo)致血管炎癥和內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）增殖加劇。

NF-κB 轉(zhuǎn)錄因子家族包括五個(gè)亞基：RELA（RELA）、RELB（RELB）、c-REL（c-REL/REL）、p105/p50（NFKB1）和 p100/p52（NFKB2），它們通過(guò)同源或異源二聚化形成活性轉(zhuǎn)錄因子。研究表明，動(dòng)脈粥樣硬化易感部位的 ECs 易導(dǎo)致 RELA 的激活增加，為這些區(qū)域炎癥加劇提供了機(jī)制解釋。盡管對(duì) ECs 活化中的 RELA 進(jìn)行了廣泛的研究，但 NF-κB 家族成員 c-REL 具有的生物學(xué)特性，在這方面仍未得到充分的研究。

最近，英國(guó)謝菲爾德大學(xué)醫(yī)藥與人口健康學(xué)院、利物浦大學(xué)分子與臨床癌癥醫(yī)學(xué)系及中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)內(nèi)分泌與代謝病研究所團(tuán)隊(duì)在一項(xiàng)最新研究中確定了內(nèi)皮 c-REL 在低剪切應(yīng)力部位促進(jìn)炎癥和 EC 增殖的作用，并闡明了該通路在動(dòng)脈粥樣硬化中的參與。該機(jī)制涉及驅(qū)動(dòng)炎癥的硫氧還蛋白互作蛋白（TXNIP）-p38（MAPK14）信號(hào)和驅(qū)動(dòng) EC 增殖的 NFKB2-p21 通路。研究成果發(fā)表于 Cardiovascular Research 期刊題為“Endothelial c-REL orchestrates atherosclerosis at regions of disturbed flow through crosstalk with TXNIP-p38 and non-canonical NF-κB pathways”。

研究人員重點(diǎn)關(guān)注內(nèi)皮細(xì)胞，通過(guò)對(duì)小鼠主動(dòng)脈弓區(qū)域進(jìn)行 En Face 染色來(lái)研究剪切應(yīng)力和 c-REL 分布之間的潛在相關(guān)性。體內(nèi)分析顯示，與外曲率（高剪切應(yīng)力；抗動(dòng)脈粥樣硬化）相比，主動(dòng)脈弓內(nèi)曲率（低剪切應(yīng)力；促動(dòng)脈粥樣硬化）的總 c-REL 水平和核 c-REL 水平均更高（圖1 A）。體外研究進(jìn)一步支持 c-REL 與剪切應(yīng)力之間的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)觀察到，與高剪切應(yīng)力（11.1 dyn/cm2）條件相比，暴露于低剪切應(yīng)力（4.8 dyn/cm2）的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）和人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（HCAECs）中 c-REL 蛋白表達(dá)顯著升高（圖1 B、C）。這些結(jié)果表明，c-REL 是由低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的，導(dǎo)致其在動(dòng)脈內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化易感區(qū)域富集。

圖1     c-Rel 通過(guò)低剪切應(yīng)力的上調(diào)在動(dòng)脈粥樣硬化誘導(dǎo)位點(diǎn)富集。

為了闡明 c-REL 在動(dòng)脈粥樣硬化易感部位的功能，首先對(duì)暴露于低剪切應(yīng)力的 HUVEC 進(jìn)行了大量 RNA 分析，并檢查了沉默 c-REL 對(duì)基因表達(dá)的影響。沉默 c-REL 改變了 2398 個(gè)基因的表達(dá)。功能注釋揭示了多個(gè)富集的基因本體術(shù)語(yǔ)，包括與炎癥相關(guān)、細(xì)胞增殖和代謝等。

然后，分析 c-REL 沉默對(duì)暴露于低剪切應(yīng)力培養(yǎng)的人 EC 的影響，驗(yàn)證其與炎癥的潛在聯(lián)系。據(jù)觀察，c-REL 的沉默導(dǎo)致 HUVECs 中炎癥粘附分子 VCAM1、ICAM1 和 E-SELECTIN 在 mRNA 和蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)顯著降低（圖2 A、B）。同樣，也導(dǎo)致暴露于低（圖2 C、D）或高剪切應(yīng)力的 HCAECs 中這些分子的降低。進(jìn)一步研究 c-REL 與炎癥之間的聯(lián)系，c-REL 過(guò)表達(dá)誘導(dǎo) VCAM-1、ICAM-1 和 E-SELECTIN 在 mRNA 和蛋白質(zhì)水平上水平升高，證實(shí)了 c-REL 對(duì)粘附分子表達(dá)的調(diào)控作用。與這些體外結(jié)果一致，小鼠主動(dòng)脈的面部染色顯示，與高剪切應(yīng)力區(qū)域相比，VCAM-1、ICAM-1 和 E-SELECTIN 在低剪切應(yīng)力區(qū)域的表達(dá)升高（圖2 E–G）。小鼠 c-Rel 的基因缺失顯著減弱了 VCAM-1、ICAM-1 和 E-SELECTIN（圖2 E-G）表達(dá)，進(jìn)一步支持 c-REL 作為炎癥分子表達(dá)的正調(diào)節(jié)因子的作用。

c-REL 是多個(gè) MAPK 通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，這促使研究人員假設(shè) MAPK 調(diào)控可能是 c-REL 驅(qū)動(dòng)的內(nèi)皮激活的基礎(chǔ)。與此一致，c-REL 的沉默導(dǎo)致 HUVECs 中 TXNIP、p38和TNF超家族成員RANK（TNFRSK11A）在mRNA和蛋白水平上的顯著降低。同樣，也導(dǎo)致暴露于低或高剪切應(yīng)力下的 HCAECs 中這些分子的降低。相反，c-REL 的過(guò)表達(dá)在 mRNA 和蛋白質(zhì)水平上誘導(dǎo) TXNIP、p38 和 RANK 水平升高。有趣的是，p38 或 TXNIP 的過(guò)表達(dá)并不能挽救 c-REL 沉默細(xì)胞中的炎癥分子表達(dá)。研究人員認(rèn)為是 c-REL 誘導(dǎo)多個(gè)信號(hào)分子，每個(gè)分子都是炎癥激活所必需的，并且恢復(fù)該網(wǎng)絡(luò)的單個(gè)成員不足以恢復(fù)炎癥。小鼠主動(dòng)脈弓的 En Face 染色證實(shí)了體外研究結(jié)果，顯示低剪切應(yīng)力區(qū) TXNIP、p38 和 RANK 的表達(dá)升高，c-Rel 的基因缺失導(dǎo)致這些蛋白表達(dá)降低。這些數(shù)據(jù)表明，c-REL 通過(guò)增強(qiáng) p38 及其上游調(diào)節(jié)因子 RANK 和 TXNIP 來(lái)促進(jìn)低剪切應(yīng)力區(qū)域的炎癥。

為了破譯其機(jī)制，研究了 c-REL 是否直接與粘附分子的啟動(dòng)子和炎性 MAP 激酶成分結(jié)合，并得出結(jié)論，c-REL 是暴露于低剪切應(yīng)力條件下的 ECs 中炎癥激活的驅(qū)動(dòng)因素，該機(jī)制涉及 c-REL 與編碼粘附蛋白的基因啟動(dòng)子的直接結(jié)合，還涉及促炎 MAP 激酶信號(hào)分子的誘導(dǎo)。

圖2    c-Rel 響應(yīng)低剪切應(yīng)力促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化易感區(qū)域的炎癥。

接下來(lái)，研究探討了 c-REL 在 EC 增殖中的作用。c-REL 的基因沉默導(dǎo)致暴露于低剪切應(yīng)力下的 HUVEC 或 HCAEC 的增殖百分比顯著降低。相反，在暴露于高剪切應(yīng)力的 EC 中，c-REL 沉默的影響相對(duì)較小。通過(guò)在低剪切應(yīng)力下的 HCAEC 中過(guò)表達(dá) c-REL 獲得了進(jìn)一步的證據(jù)，其顯著提高了表達(dá)細(xì)胞增殖標(biāo)志物 PCNA 和 Ki67 的細(xì)胞比例。小鼠主動(dòng)脈中表面染色一致顯示，與高剪切應(yīng)力條件相比，低剪切應(yīng)力條件下 EC 增殖增強(qiáng)。此外，c-Rel 的基因缺失顯著減弱了主動(dòng)脈低剪切應(yīng)力區(qū)域的細(xì)胞增殖，表明 c-Rel 有助于在低剪切應(yīng)力部位增加局部 EC 增殖。

為了破譯該機(jī)制，重點(diǎn)分析了NFKB2 上游的非經(jīng)典 NF-κB 信號(hào)通路。該通路是通過(guò)激活 NF-κB 誘導(dǎo)激酶NIK（MAP3K14）啟動(dòng)的，該激酶促進(jìn) p100 蛋白水解加工為 p52，隨后易位到細(xì)胞核。免疫印跡顯示，低剪切應(yīng)力提高了 HUVEC（圖3 A）和 HCAEC（圖3 B）中 p100 和活性 p52 NF-κB 亞基的表達(dá)，而 c-REL 沉默則顯著減弱了其表達(dá)（圖3 C、D）。在 p100/p52 的上游沉默 HUVEC（圖3 E）和 HCAEC（圖3 F）中 c-REL 降低了 NIK 的表達(dá)。因此，可得出結(jié)論，c-REL 可以與 NIK 啟動(dòng)子中一個(gè)假定的 c-REL 結(jié)合位點(diǎn)相互作用。一致地，小鼠主動(dòng)脈的表面染色顯示，NIK 在低剪切區(qū)的表達(dá)增強(qiáng)，并且分析c-RelKO小鼠證明 c-Rel 是該部位 NIK 富集所必需的（圖3 G）。

研究人員推斷非經(jīng)典 NF-κB 是 EC 增殖的驅(qū)動(dòng)因素，因?yàn)?NFKB2 的基因缺失在主動(dòng)脈的低剪切應(yīng)力位點(diǎn)表現(xiàn)出增殖減少的趨勢(shì)。同樣，NFKB2 的沉默顯著降低了體外暴露于低剪切應(yīng)力條件下的 HUVEC 和 HCAEC 中增殖細(xì)胞的百分比。在機(jī)制水平上，通過(guò)在暴露于低剪切應(yīng)力的 HUVEC 或 HCAEC 中沉默 NFKB2 或 c-REL，細(xì)胞周期抑制劑p21（CDKN1A）的表達(dá)增強(qiáng)。

這些發(fā)現(xiàn)表明，c-REL 通過(guò)激活非經(jīng)典 NF-κB 信號(hào)以抑制 p21 來(lái)驅(qū)動(dòng)低剪切應(yīng)力位點(diǎn)的 EC 增殖。與 p21 在衰老中的作用一致，實(shí)驗(yàn)觀察到，c-REL 沉默增強(qiáng)了暴露于低剪切應(yīng)力的 HCAEC 中衰老的兩個(gè)標(biāo)志物 H2AX 和 p53 的表達(dá)。相比之下，c-REL 沉默不會(huì)改變 HCAEC 中的細(xì)胞凋亡，對(duì) HUVEC 的影響相對(duì)溫和。

圖3     c-Rel 可增強(qiáng)響應(yīng)低剪切應(yīng)力的非經(jīng)典 NFKB2 激活。

鑒于c-REL在調(diào)節(jié)血管炎癥中的關(guān)鍵作用，研究假設(shè)c-REL可能影響動(dòng)脈粥樣硬化。與對(duì)照組相比，AAV-PCSK9 的給藥和暴露于西方飲食 6 周后（模擬動(dòng)脈粥樣硬化），全身性 c-Rel 缺失（c-RelKO）小鼠顯示主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊減少，血漿甘油三酯和膽固醇水平也降低。進(jìn)一步分析表明，c-Rel 調(diào)節(jié)血漿膽固醇水平，可能涉及肝臟膽固醇代謝。

最后，為了具體分析內(nèi)皮 c-REL 對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的影響，生成內(nèi)皮特異性c-REL 敲除（c-RelECKO）和對(duì)照小鼠。AAV-PCSK9 處理并暴露于西方飲食 8 周以誘發(fā)高膽固醇血癥后，c-RelECKO組與對(duì)照組相比，小鼠的主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊顯著較小（圖4 A），而血漿膽固醇和甘油三酯水平保持不變（圖4 B）。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了內(nèi)皮 c-Rel 是動(dòng)脈粥樣硬化的驅(qū)動(dòng)因素，這與它在動(dòng)脈樹的動(dòng)脈粥樣硬化區(qū)促進(jìn)炎癥和內(nèi)皮細(xì)胞更新的能力是一致的。

這些發(fā)現(xiàn)表明，內(nèi)皮 c-Rel 通過(guò)在疾病易發(fā)區(qū)域誘導(dǎo)促動(dòng)脈粥樣硬化炎癥分子來(lái)促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化。此外，靶向 c-REL 可能具有保護(hù)血管系統(tǒng)和降低血漿脂蛋白水平以減輕動(dòng)脈粥樣硬化的雙重好處。

圖4     內(nèi)皮 c-Rel 驅(qū)動(dòng)動(dòng)脈粥樣硬化。

圖5     圖形概要

總之，該研究表明，內(nèi)皮 c-REL 通過(guò)激活導(dǎo)致炎癥的 TXNIP-p38 通路和驅(qū)動(dòng)增殖的 NF-κB2-p21 通路，協(xié)調(diào)血流紊亂部位動(dòng)脈粥樣硬化的啟動(dòng)。抑制 c-REL 提供了一種新的治療策略，以增強(qiáng) EC 功能和緩解動(dòng)脈粥樣硬化。

參考文獻(xiàn)：Tardajos Ayllon B, Bowden N, Souilhol C, Darwish H, Tian S, Duckworth C, Pritchard DM, Xu S, Sayers J, Francis S, Serbanovic-Canic J, Oakley F, Evans PC. Endothelial c-REL orchestrates atherosclerosis at regions of disturbed flow through crosstalk with TXNIP-p38 and non-canonical NF-κB pathways. Cardiovasc Res. 2025 Feb 21:cvaf024. doi: 10.1093/cvr/cvaf024. Epub ahead of print. PMID: 39982773.

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