細(xì)胞凋亡檢測(cè)

細(xì)胞凋亡作為程序性死亡的核心形式，在發(fā)育調(diào)控、疾病機(jī)制(如癌癥、免疫缺陷)及藥物研發(fā)中具有重要研究?jī)r(jià)值。針對(duì)其復(fù)雜動(dòng)態(tài)過(guò)程，現(xiàn)有檢測(cè)方法大致可分為基于細(xì)胞形態(tài)、生物學(xué)功能和生化標(biāo)記三大類。

本文將系統(tǒng)梳理常用方法的實(shí)驗(yàn)原理與實(shí)驗(yàn)步驟，并結(jié)合典型產(chǎn)品推薦，為研究者提供參考。

01

基于細(xì)胞形態(tài)

1.1 電鏡分析

透射電子顯微鏡 (TEM) 被認(rèn)為是檢測(cè)細(xì)胞凋亡的金標(biāo)準(zhǔn)。

細(xì)胞凋亡的主要特征是：(1) 電子致密核 (早期邊緣化)；(2) 核碎裂；(3) 完整的細(xì)胞膜；(4) 雜亂無(wú)章的細(xì)胞質(zhì)、 細(xì)胞器；(5) 大而透明的空泡；(6) 細(xì)胞表面有氣泡。

如 Figure 4 所示，TEM 顯示 BBR (小檗堿) 或 DDP (順鉑) 誘導(dǎo)大量 OVCAR3 細(xì)胞凋亡。變化主要包括細(xì)胞 質(zhì)皺縮、質(zhì)膜起泡、染色質(zhì)濃縮和凋亡小體形成。透射電鏡的主要缺點(diǎn)是成本高，一次只能檢測(cè)一小塊區(qū)域，難以及早發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞[1][5]。

Figure 4. TEM 檢測(cè)小檗堿 (BBR) (100 μΜ) 和順鉑 (DDP) (5 μg/mL) 誘導(dǎo) OVCAR3 細(xì)胞 24 h 后的細(xì)胞凋亡形態(tài)[5]。

1.2 細(xì)胞核染色分析

在凋亡細(xì)胞中，質(zhì)膜通透性和染色質(zhì)濃縮發(fā)生變化，可以使用 DAPI、Hoechst 以及碘化丙啶 (PI) 熒光染料， 通過(guò)流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡輕松檢測(cè)到。

Figure 5. DAPI, Hoechst 和 PI 的熒光染色效果圖[6][7]。

(A) 甲基乙二醛(MG)(1.5 mM, 24 h)誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡，并用PI和Hoechst 33342染色。

(B) DAPI(藍(lán)色)和TUNEL(綠色)染色凋亡的MODE-K細(xì)胞。

MCE相關(guān)產(chǎn)品

02

基于生物學(xué)功能

2.1 Annexin V/PI 雙染法

Annexin V 屬于 Ca2+-依賴性磷脂結(jié)合蛋白，可特異性粘附細(xì)胞膜上的磷脂酰絲氨酸 (PS)。在健康細(xì)胞中， PS 位于質(zhì)膜的胞質(zhì)側(cè)，但在凋亡早期轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜外。因此，熒光標(biāo)記 (如 FITC、EGFP 標(biāo)記) 的 Annexin V 可用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡早期細(xì)胞膜胞外側(cè) PS 的存在。PI 一般可與 Annexin V 結(jié)合以區(qū)分凋亡和壞死細(xì)胞，可通過(guò)流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡檢測(cè)[8]。

Figure 6. DAPI, Annexin V-FITC 和 PI 共染的代表性圖像，顯示 Bufalin (100 nM, 48 h) 誘導(dǎo) HepG2 細(xì)胞凋亡[9]。(A) 共聚焦圖像, (B) 流式細(xì)胞術(shù)分析。

MCE 相關(guān)產(chǎn)品

Annexin V/PI 雙染法參考[9]：

1. 對(duì)于懸浮細(xì)胞: 1000 ×g 離心 5 分鐘，棄上清。加入 1 mL 預(yù)冷的 PBS 輕輕重懸, 1000 ×g 離心 5 分鐘， 棄上清。 對(duì)于貼壁細(xì)胞: 用 PBS 清洗細(xì)胞并加入胰蛋白酶 (不含 EDTA) 以分離細(xì)胞。添加新鮮培養(yǎng)基并輕輕懸浮細(xì)胞 制成單細(xì)胞懸浮液。1000 ×g 離心 5 分鐘，然后棄去上清液。加入 1 mL 預(yù)冷的 PBS 重懸細(xì)胞沉淀，1000 ×g 離心 5 分鐘棄上清，保留細(xì)胞沉淀。

2. 將細(xì)胞重新懸浮于 195 μL Binding Buffer 中。 加入 5 μL Annexin V-FITC、10 μL PI (Propidium Iodide)，室溫避光 孵育 10-20 min。孵育過(guò)程中可輕輕顛倒數(shù)次 ，以加強(qiáng)染色效果。

3. 檢測(cè)與分析

(1) 流式細(xì)胞儀檢測(cè): Annexin V-FITC (Ex=488 nm; Em=525 nm) 綠色熒光，在 FL1 通道檢測(cè)；

PI-DNA (Ex=535 nm; Em=617 nm) 紅色熒光，在 FL2 或 FL3 通道檢測(cè)?；罴?xì)胞呈現(xiàn)為 Annexin V? /PI?陰性， 早期凋亡細(xì)胞為 Annexin V+ /PI? ，而晚期凋亡細(xì)胞為 Annexin V+ /PI+ 。

(2) 熒光顯微鏡檢測(cè): 1000 ×g 離心 5 分鐘，棄去上清，加入 50-100 μL Binding Buffer 輕輕重懸細(xì)胞沉淀，涂片后用熒光顯微鏡檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

2.2 線粒體膜電位檢測(cè)

細(xì)胞凋亡被認(rèn)為與線粒體通透性孔的開(kāi)放和電化學(xué)梯度的喪失有關(guān)，線粒體跨膜電位 (?ΨM) 的下降是細(xì)胞凋亡 的標(biāo)志，可用于早期細(xì)胞凋亡檢測(cè)。 JC-1 染料是一種親脂性陽(yáng)離子染料，廣泛用于檢測(cè)多種細(xì)胞類型的 ?ΨM 變化。其原理為: 在具有較高 ?ΨM 的健康細(xì)胞中，JC-1 染料可進(jìn)入細(xì)胞并在線粒體中積累，形成 J-aggregates (Ex/Em=585/590 nm, 橙紅色熒光)。在凋亡細(xì)胞中，?ΨM 較低，JC-1 染料進(jìn)入線粒體較少，以單體形式存在 (Ex/Em=510/527 nm, 綠色熒光)。

因此，通過(guò)熒光顯微鏡或流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) JC-1 的紅/綠熒光比值可用于評(píng)估細(xì)胞凋亡狀態(tài)[10]。

MCE相關(guān)產(chǎn)品

JC-1 染色參考[11]：

懸浮細(xì)胞

1. 以 6 孔板為例，每孔用 1 mL 培養(yǎng)基重懸 100 萬(wàn)細(xì)胞，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)處理細(xì)胞。

2. 細(xì)胞染色

(1) 陽(yáng)性對(duì)照：取適量CCCP (50 mM)恢復(fù)至室溫，在陽(yáng)性對(duì)照孔中加入1 μL (終濃度為50 μM)，37℃孵育5 分鐘 。

(2) 實(shí)驗(yàn)組：取適量 JC-1 (200 μM) 恢復(fù)至室溫，每孔加入 10 μL (終濃度為 2 μM)。37°C，避光孵育 15-20 分鐘。

3. 孵育結(jié)束后，400 ×g 4℃ 離心 3-4 分鐘，沉淀細(xì)胞，棄上清。

4. 用 PBS (1×) 洗滌 2 次：加入 2 mL PBS (1×) 重懸細(xì)胞，400 ×g 4℃ 離心 3-4 分鐘，沉淀細(xì)胞，棄上清。

5. 用 500 μL 的 PBS (1×) 重懸細(xì)胞。

6. 用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察，也可以用熒光分光光度計(jì)或流式細(xì)胞儀分析 (JC-1 單體呈現(xiàn)綠色熒光： Ex/Em=510/527 nm；JC-1 聚集體呈現(xiàn)紅色熒光：Ex/Em=585/590 nm)。

貼壁細(xì)胞

1. 若用熒光分光光度計(jì)或流式細(xì)胞儀檢測(cè)貼壁細(xì)胞，可先對(duì)貼壁細(xì)胞進(jìn)行消化、收集，重懸后參考懸浮細(xì)胞的 檢測(cè)方法。

2. 若用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)，JC-1 染色完成后棄上清，用 PBS (1x) 洗滌 2 次，加入 500 μL PBS (1x)，用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察即可。

Figure 7. Ang/TAT-sgGSS-EVs 處理膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞48h 后，通過(guò) JC-1 (HY-15534) 檢測(cè)線粒體膜電位變化 (顯著下降)[12]。

結(jié)果顯示，經(jīng) Ang/TAT-sgGSS-EVs 處理后，線粒體膜電位 MMP (?φM) 顯著降低，具體表現(xiàn)為綠/紅熒光比值 增加。表明 Ang/TAT-sgGSS-EVs 有效地破壞了靶基因并加劇了放射治療 (RT) 引起的鐵死亡。

03

基于生物學(xué)功能

3.1 凋亡相關(guān)標(biāo)志物檢測(cè)

如前所述，細(xì)胞凋亡途徑最終均導(dǎo)致 Caspase-3 的切割和激活。因此，可以通過(guò) Caspase-3 來(lái)對(duì)晚期細(xì)胞 凋亡進(jìn)行檢測(cè)。此外，細(xì)胞凋亡的其他生物標(biāo)志物還包括活化的 Caspases 2/7/8/9, Cytochrome c, Bcl-2/Bcl-xl/Mcl-1, PARP 等。這些生物標(biāo)志物可以通過(guò)多種方式檢測(cè)，包括免疫印跡、免疫沉淀和免疫組化[13]。

Figure 8. Infliximab (10 μg/mL, 24/48 h) 而非Etanercept (10 μg/mL, 24/48 h)

激活淋巴細(xì)胞中的 Caspase 3 (通過(guò)Western blot檢測(cè))[14]。

熱銷凋亡相關(guān)檢測(cè)抗體

Caspase 3 分析試劑盒 VF 488 Caspase 3 活細(xì)胞分析試劑盒 (HY-K1088

3.2 DNA 片段檢測(cè)

3.2.1 DNA 階梯技術(shù)

在凋亡細(xì)胞中，DNA 被核酸內(nèi)切酶切割，細(xì)胞凋亡的后期會(huì)發(fā)生 DNA 片段化。從而導(dǎo)致了一個(gè)特征性的“DNA 階梯”(在瓊脂糖凝膠上顯現(xiàn))，階梯中的每個(gè)條帶大小相隔大約 180 個(gè)堿基對(duì)。因此，可通過(guò) DNA 階梯技術(shù)來(lái) 進(jìn)行檢測(cè)[1]。

Figure 9. 暴露于 DNA 損傷條件 (UV, Etoposide 30 μM, γ 100 Gy) 下， Jurkat 細(xì)胞中的 DNA 片段化[15]。

3.2.2 TUNEL 染色法

TUNEL 染色法的原理是：片段化的 DNA 末端產(chǎn)生游離的 3’-OH 基團(tuán)。熒光探針標(biāo)記的 Dutp 可通過(guò)末端 脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 (TdT) 添加到暴露的 3'-OH 基團(tuán)上，從而使 DNA 片段產(chǎn)生熒光，可通過(guò)熒光顯微鏡或者 流式細(xì)胞儀來(lái)檢測(cè)[16]。

MCE相關(guān)產(chǎn)品

TUNEL 染色法參考 (HY-K1079 為例)：

1. 懸浮細(xì)胞樣品處理

(1) 洗滌：離心收集細(xì)胞 (不超過(guò) 2×106 個(gè)細(xì)胞)，加入 PBS 洗滌 2 次，每次 5 分鐘。

(2) 固定：加入固定液 4℃ 固定 30 分鐘。建議置于搖床上固定，以防止細(xì)胞聚團(tuán)。

(3) 洗滌：加入 PBS 洗滌 2 次，每次 5 分鐘。輕輕棄去 PBS，并用濾紙吸去多余的液體。

(4) 通透：加入通透液室溫孵育 5 分鐘。

(5) 洗滌：加入 PBS 洗滌 2 次，每次 5 分鐘。輕輕棄去 PBS，并用濾紙吸去多余的液體。

注：貼壁細(xì)胞/石蠟切片/冰凍切片樣品處理方法見(jiàn) MCE 產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。

2. 標(biāo)記與檢測(cè)

(1) 加入 50 μL TUNEL 工作液，37℃ 避光孵育 1 小時(shí)。

(2) 加入 PBS 洗滌 3 次。加入 250-500 μL PBS 充分懸浮細(xì)胞。

(3) 用流式細(xì)胞儀檢測(cè)或涂片后在熒光顯微鏡下觀察。Cy3 (Ex=550 nm; Em=570 nm) 染色后，凋亡細(xì)胞顯示 紅色熒光 (用 HY-K1078 則凋亡細(xì)胞呈綠色熒光)，正常細(xì)胞無(wú)熒光。

注：若 TUNEL 反應(yīng)過(guò)強(qiáng)，可用 TdT Dilution Buffer 將 TdT Enzyme 稀釋 2-5 倍后再進(jìn)行操作。

Figure 10. 高滲 500 mOsm 培養(yǎng)基中角膜上皮細(xì)胞死亡增加，SP600125 (20 μM, 24 h) 顯著減少細(xì)胞死亡 (通過(guò) TUNEL 染色確定) [17]。

無(wú)論是基礎(chǔ)研究或藥物開(kāi)發(fā)，精準(zhǔn)檢測(cè)細(xì)胞凋亡是關(guān)鍵。形態(tài)學(xué)方法驗(yàn)證結(jié)構(gòu)變化，功能學(xué)工具（如膜電位檢測(cè)）揭示機(jī)制，生化標(biāo)記（如TUNEL）量化結(jié)果。MCE多款明星產(chǎn)品（如Annexin V-FITC試劑盒、Caspase-3抗體）適配不同場(chǎng)景，助您高效獲取高質(zhì)量數(shù)據(jù)。

04

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