猪肝星状细胞永生化细胞专用培养基冻存 

1）离心完成后，弃上清，用 1mL 冻存液重悬细胞沉淀，然后转入 1.8ml 冻存管中；

2）将冻存管转入填充满异丙醇的程序降温盒中，之后转入-80℃冰箱中过夜降温；

3）第二天，取出降温完成的序降温盒中的冻存管，尽快转入液氮罐中保存。续写内容如下：

为确保细胞冻存后的存活率和功能稳定性，后续还需进行复苏验证。具体步骤如下：

1. **复苏准备**：从液氮罐中取出冻存管，迅速置于37℃水浴中轻柔摇晃，使细胞悬液在1-2分钟内融化。注意避免长时间高温暴露，以防细胞损伤。

2. **离心洗涤**：将融化的细胞悬液转移至15mL离心管中，缓慢加入5mL预热的培养基以稀释冻存液。随后以300×g离心5分钟，弃上清以去除残留的冻存?；ぜ?。

3. **重悬接种**：用适量新鲜培养基重悬细胞沉淀，轻柔吹打均匀后接种至预处理好的培养皿中，置于37℃、5% CO?培养箱中静置培养。24小时后观察细胞贴壁情况，更换新鲜培养基以去除未存活细胞碎片。

4. **质量评估**：复苏后48小时，通过台盼蓝染色计数活细胞比例，同时可进行免疫荧光染色（如GFAP、α-SMA）或功能实验（如吞噬检测）以确认星状细胞的表型和活性。若活率低于80%，需优化冻存程序或调整冻存液配方。

**注意事项**：

- 全程操作需无菌，避免反复冻融；

- 液氮储存时确保冻存管密封性，防止爆炸风险；

- 长期保存需定期检查液氮罐液位，避免细胞失活。

通过上述标准化流程，可最大限度保留猪肝星状细胞的永生化特性，为后续肝纤维化研究或药物筛选提供稳定细胞资源。