一、乳酸脫氫酶法的原理

乳酸脫氫酶（LDH）是一種廣泛存在于各種細胞中的穩(wěn)定酶，正常情況下，細胞膜的完整性能夠防止 LDH 泄漏到細胞外。然而，當細胞受到毒性物質的損傷、發(fā)生凋亡或壞死導致細胞膜破損時，LDH 會迅速釋放到細胞培養(yǎng)基中。細胞毒性檢測試劑盒（乳酸脫氫酶法）正是基于這一原理，通過檢測細胞培養(yǎng)基中 LDH 的活性來定量評估細胞膜損傷程度以及細胞毒性。

LDH 在細胞內(nèi)的濃度相對穩(wěn)定，且在細胞受損后釋放迅速，這使得它成為檢測細胞毒性和細胞死亡的理想標志物。該方法具有高度的靈敏性和特異性，能夠準確反映細胞受損的情況，且不受細胞種類和培養(yǎng)條件的顯著影響。

二、試劑盒的組成與操作流程

試劑盒的組成

細胞毒性檢測試劑盒（乳酸脫氫酶法）主要包含以下幾種關鍵組分：

• LDH 檢測試劑：含有特定的底物和輔助因子，能夠與 LDH 發(fā)生反應，生成可檢測的產(chǎn)物。在反應過程中，LDH 催化乳酸和 NAD? 氧化生成丙酮酸和 NADH，隨后通過一系列反應生成可被比色或熒光檢測的產(chǎn)物。

• 反應緩沖液：提供一個適宜的反應環(huán)境，確保 LDH 酶活性的穩(wěn)定發(fā)揮，同時保證反應的特異性和靈敏度。其成分經(jīng)過精心優(yōu)化，以消除其他因素對檢測結果的干擾。

操作流程

細胞培養(yǎng)與處理

根據(jù)實驗需求，將細胞接種于適當?shù)呐囵B(yǎng)容器中，并進行相應的處理，如添加待測藥物、化學物質或其他刺激因素。設置多個重復孔以提高實驗數(shù)據(jù)的可靠性。將培養(yǎng)容器置于細胞培養(yǎng)箱中，在適宜的溫度（一般為 37℃）、濕度和二氧化碳濃度（通常為 5%）條件下孵育細胞，使細胞充分接觸處理因素并產(chǎn)生相應的反應。

收集培養(yǎng)上清液

孵育結束后，輕輕吸出培養(yǎng)孔中的上清液，注意避免對細胞造成機械損傷。將收集到的上清液置于冰上或 4℃保存，以防止 LDH 的降解或失活。上清液中釋放的 LDH 活性與細胞膜受損的細胞數(shù)量成正比，是評估細胞毒性的關鍵樣本。

加入檢測試劑并孵育

將收集到的上清液轉移至新的反應孔中，按照試劑盒說明書的要求加入適量的 LDH 檢測試劑和反應緩沖液。輕輕混勻后，在室溫下避光孵育一定時間，通常為 15 - 30 分鐘。孵育過程中，LDH 與檢測試劑發(fā)生反應生成可檢測的產(chǎn)物。

比色測定與結果分析

使用酶標儀在特定波長下（一般為 490 - 500 nm）測量反應孔中的吸光度值。根據(jù)標準曲線或已知濃度的 LDH 樣品，計算出樣本中 LDH 的活性或濃度。LDH 活性越高，表明細胞膜受損的細胞數(shù)量越多，細胞毒性越強。通過比較處理組與對照組的 LDH 活性，可以定量評估待測物質的細胞毒性。

三、應用實例與優(yōu)勢

應用實例

藥物毒性篩選

在藥物研發(fā)過程中，細胞毒性檢測試劑盒（乳酸脫氫酶法）被廣泛用于篩選化合物的細胞毒性。通過測定不同濃度藥物處理后的細胞培養(yǎng)上清液中的 LDH 活性，可以確定藥物的半數(shù)抑制濃度（IC??），從而評估藥物的潛在毒性。這有助于在藥物研發(fā)的早期階段排除具有高毒性的候選化合物，提高藥物研發(fā)的成功率。

化學物質毒性評估

對于環(huán)境化學物質、食品添加劑等的毒性評估，該試劑盒提供了一種快速、靈敏的檢測手段。能夠快速評估這些化學物質對細胞的潛在危害，為食品安全和環(huán)境保護提供科學依據(jù)。

優(yōu)勢分析

• 靈敏度高：LDH 法對細胞毒性變化的檢測非常靈敏，能夠檢測到少量細胞受損釋放的 LDH，適用于各種細胞類型和不同毒性程度的檢測。即使是低水平的細胞膜損傷，也能通過 LDH 活性的變化準確反映出來，這對于早期毒性評估和低毒性化合物的篩選具有重要意義。

• 特異性強：LDH 作為細胞內(nèi)的穩(wěn)定酶，其釋放主要與細胞膜損傷相關，因此 LDH 法具有較高的特異性。與其他細胞毒性檢測方法（如基于代謝活性的 MTT 法）相比，LDH 法不受細胞代謝狀態(tài)變化的影響，能夠更準確地反映細胞膜的完整性損傷，避免了因細胞代謝差異導致的假陽性或假陰性結果。

• 操作簡便：該試劑盒的操作流程簡單易行，無需復雜的儀器設備和特殊的技術要求。僅需常規(guī)的細胞培養(yǎng)設備和酶標儀，即可完成從細胞處理到結果檢測的全過程。這使得該方法易于在不同實驗室之間推廣和應用，特別適合高通量篩選和大規(guī)模實驗。

• 穩(wěn)定性好：LDH 在細胞培養(yǎng)基中相對穩(wěn)定，能夠在較長時間內(nèi)保持活性。這使得樣本的收集和檢測可以靈活安排，無需嚴格精確的時間控制，為實驗操作提供了更大的便利性。同時，試劑盒的組成成分穩(wěn)定性高，保存時間長，有利于實驗的連續(xù)開展和重復性驗證。

四、注意事項與質量控制

注意事項

• 避免樣本污染：在操作過程中，應嚴格遵循無菌操作原則，避免樣本受到微生物污染。污染可能會影響 LDH 的活性檢測結果，導致數(shù)據(jù)偏差。使用無菌的試劑、耗材和培養(yǎng)容器，并在超凈工作臺中進行操作。

• 控制實驗條件：實驗條件的一致性對于準確評估細胞毒性至關重要。包括細胞密度、處理時間、溫度、濕度和二氧化碳濃度等，都應保持穩(wěn)定。細胞密度過高或過低可能影響檢測靈敏度；處理時間的差異可能導致 LDH 釋放量的不同；溫度和氣體條件的變化會影響細胞的代謝和酶活性。

• 及時檢測：收集到的培養(yǎng)上清液應盡快進行檢測，以防止 LDH 的降解或失活。若不能立即檢測，應將樣本置于冰上或 4℃短期保存（不超過 6 小時），對于長期保存（超過 6 小時），建議將樣本置于 -20℃或 -80℃冷凍保存，但需注意避免反復凍融，以免影響 LDH 活性。反復凍融會使 LDH 發(fā)生變性，導致活性降低，影響檢測結果的準確性。

• 避免溶血和細胞碎片干擾：在收集培養(yǎng)上清液時，應輕柔操作，避免劇烈振蕩或機械損傷細胞，以防溶血和細胞碎片釋放 LDH，從而干擾檢測結果。溶血會使大量 LDH 從紅細胞中釋放，導致檢測結果偏高；細胞碎片中的 LDH 也可能被誤判為細胞毒性釋放的 LDH，影響對實際細胞膜損傷程度的準確評估。

質量控制

• 設置對照：每次實驗都應設置適當?shù)膶φ战M，包括空白對照（僅含培養(yǎng)基）、陰性對照（未處理的正常細胞）和陽性對照（使用已知毒性物質處理的細胞）。通過比較不同組別的 LDH 活性，可以驗證實驗的可靠性和準確性，同時排除實驗中可能出現(xiàn)的非特異性干擾因素?？瞻讓φ沼糜谛拭笜藘x的背景吸光度；陰性對照反映正常細胞的 LDH 本底水平；陽性對照用于評估實驗系統(tǒng)的靈敏度和檢測限。

• 重復實驗：為了確保數(shù)據(jù)的可靠性，建議進行多次獨立重復實驗。統(tǒng)計學分析可幫助評估數(shù)據(jù)的離散性和變異性，如計算平均值、標準差、標準誤以及進行 t 檢驗等。多次重復實驗的結果一致性高，表明實驗數(shù)據(jù)具有較高的可信度。

• 使用標準品：試劑盒通常提供 LDH 標準品，用于建立標準曲線。在每次實驗中，應同時測定標準品的吸光度值，并繪制標準曲線。通過標準曲線可以準確計算樣本中 LDH 的活性或濃度，消除實驗間差異和試劑批次間的影響，確保不同實驗結果之間的可比性。